（征求意见稿）畜禽血清中AFB1生物标志物的测定—高效液相色谱法.docx

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1、ICS点击此处添加ICS号点击此处添加中国标准文献分类号     DB34安徽省地方标准DB34/XXXXX—XXXX     畜禽血清中AFB1生物标志物的测定—高效液相色谱法DeterminationofAFB1biomarkerinanimalserum—Highperformanceliquidchromatographicmethod点击此处添加与国际标准一致性程度的标识     XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施安徽省市场监督管理局   发布DB34/T—XXXX前  言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规

2、则起草。本标准由安徽农业大学提出。本标准由安徽省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：安徽农业大学，农业农村部猪肉质量安全控制重点实验室，望江县小月山农业发展有限公司，和县农业农村局，望江县畜牧兽医局，安徽省动物疫病预防与控制中心，安徽省农业科学院，宿松县春润食品有限公司。本标准起草人：王希春，杨长根，高亚飞，陈祥国，赵家喜，王军，汤继顺，赵杰，吴金节，李玉，冯士彬，孙裴，涂健，冯江华。IDB/XXXXX—XXXX畜禽血清中AFB1生物标志物的测定—高效液相色谱法1　范围本标准规定了畜禽血清中黄曲霉毒素B1（AFB1）生物标志物高效液

3、相色谱法测定的原理、试剂和设备、分析步骤、分析结果的表述、重复性、检出限与定量限、回收率。本标准适用于畜禽血清中AFB1生物标志物的测定。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法3　原理通过蛋白酶的消化作用，从血清白蛋白中释放出AFB1生物标志物（AFB1-Lysine），并采用固相萃取柱进一步浓缩。浓缩的AFB1生物标志物经高效液相色谱仪进行分离，在激发波长为4

4、05nm和发射波长470nm的荧光检测器中检测。4　试剂和设备4.1　试剂4.1.1　甲醇（CH3OH）：色谱纯。4.1.2　磷酸二氢铵（NH4H2PO4）。4.1.3　叠氮化钠（NaN3）。4.1.4　白蛋白试剂（DMA）。4.1.5　蛋白检测染料试剂浓缩液（考马斯亮蓝G-250）。4.1.6　氯化钠（NaCl）。4.1.7　磷酸氢二钠（Na2HPO4）。4.1.8　磷酸二氢钾（KH2PO4）。4.1.9　氢氧化铵（(NH4OH）。4.1.10　甲酸（HCOOH）。4.2　设备4.2.1　高效液相色谱仪，带荧光检测器。4.2.2　固相萃

5、取柱。4.2.3　粒径5µmC18高效液相色谱柱（250×4.6mm）。8DB/XXXXX—XXXX1.1.1　涡旋振荡器。1.1.2　微量进样器。1.1.3　天平：感量0.0001g。1.1.4　pH计。1.1.5　超低温冰箱。1.1.6　离心机：转速≥4000r/min。2　分析步骤5.1样品制备采集新鲜血液5mL，室温静置2h，于4℃、3000r/min离心15min，取上清液转移至另一离心管中。5.2总蛋白及白蛋白含量测定5.2.1血清总蛋白浓度测定4℃下取1mg/mL蛋白标准品置于玻璃管中用于制备标准曲线，各管添加量见表1；取待

6、测血清5μL至离心管中，加入95μL水稀释样品，涡旋混合均匀，然后将4μL稀释样品转移到预先添加796μL色谱级用水的玻璃管中；向所有管中加入200μL考马斯亮蓝G-250，室温下涡旋，混合均匀转移至待测试管中；以试管1作为空白，在595nm的紫外波长下，使用分光光度计进行测量；记录标准品和样品的吸光度读数，根据标准吸光度制作标准曲线，由公式计算可得总蛋白浓度。表1血清总蛋白标准曲线绘制序号标准溶液(μL)HPLC用水(μL)标准(μg)10800022798234796446794658792861079010715785158DB/X

7、XXXX—XXXX血清总蛋白含量计算公式见（1）（2）（3）：标准曲线:y=ax+b……………………………………………………(1)X———(A-b)/a（μg）………………………………………………(2)150μL血清总蛋白浓度C=Xμg/mL×20×250×150μL/1000（μg）.............................………(3)式中：X———待测血清中总蛋白含量（μg）；A———待测血清吸光度读数。5.2.2血清白蛋白含量测定4℃下取4g/dL蛋白标准品溶液置于玻璃管中用于制备标准曲线，各管添加量见表2；取待测血

8、清10μL置于一个单独的玻璃管，并在管内加10μL色谱级用水；向所有管中加入1mLDMA，室温下涡旋；混合均匀转移至待测试管中，以试管1作为空白，在630nm的紫外波长下，使用分光光度计进行测