作物青枯病LAMP检测技术规程（征求意见稿）.doc

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1、ICS点击此处添加中国标准文献分类号DB江西省地方标准DB36/XXXXX—XXXX作物青枯病LAMP检测技术规程TechniquelyRulesforLAMPDetectiononTuberCropsBacterialWilt[Ralstoniasolanacearum(Smith)]点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施江西省市场监督管理局发布DB36/XXXXX—XXXX目次前言II11术语和定义12　样品采集13　样品处理24　LAMP反应25　LA

2、MP检测结果判断2附录A（资料性附录）　LAMP检测引物、5×LAMP混合引物配制及反应体系和条件34DB36/XXXXX—XXXX前言本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由江西省农业农村厅提出并归口。本标准起草单位：江西省农业科学院植物保护研究所、江西生物科技职业学院、江西省植保植检站。本标准主要起草人：李信申、曾荣、华菊玲、黄小梅、陈建、黄瑞荣、黄建华、王希。4DB36/XXXXX—XXXX作物青枯病LAMP检测技术规程范围本标准规定了马铃薯、甘薯、芝麻、花生、烟草及茄科蔬菜等作物

3、青枯病（bacterialwilt）的LAMP检测技术。本标准适用于马铃薯、甘薯、芝麻、花生、烟草及茄科蔬菜等作物青枯病LAMP检测。1　术语和定义下列术语和定义适用于本标准。1.1　LAMP扩增技术Loop-mediatedisothermalamplification环介导等温扩增技术（简称LAMP扩增技术）是一种可于特定恒温条件下，实现短时间内对靶标序列高效扩增的技术。检测结果通过肉眼观察绿色荧光的生成进行判断。该技术具有“简便、快速、精确、低价”的特点。已广泛用于病害的诊断及病原菌的定性定量检测。

4、1.2　引物primer指一小段单链DNA或RNA，作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延伸的出发点而起作用的多核苷酸链。1.3　反应体系LAMP反应体系主要要素为：外引物、内引物、dNTP、Bst2.0DNA聚合酶、10×ThermoPolbuffer缓冲液、MgSO4、Mncl2、甜菜碱、模板和钙黄绿素。在恒温条件下，Bst2.0DNA聚合酶通过链置换催化靶基因片段合成；而反应体系中的染料与Mn2+结合发生颜色变化，达到可视化目的。2　样品采集将新鲜的疑似病株用吸水纸包好，

5、整株带回实验室，保存于4℃冰箱，备用。4DB36/XXXXX—XXXX1　样品处理截取适量待检测样品，悬浮于装有适量无菌水的试管中并剪碎，静置30min；或加适量无菌水研磨，静置5min，取上清液。以悬浮液或上清液为模板，以无菌水为空白对照，进行LAMP检测。2　LAMP反应以提取的疑似作物病株样品组织悬浮液或上清液为模板，以模式菌株GMI1000菌悬液为阳性模板，以无菌水为阴性模板，采用特异性引物（附件A）对待测样品进行LAMP检测。扩增反应在25μL体系中进行，各组分如下：2.5μL10×Thermo

6、Polbuffer[20mMTris-HCl(PH8.8),10mMKCl,10mM(NH4)2SO4,2mMMgSO4,0.1%TritonX-100)，3.5μL10mMdNTP，1.5μL100mMMgSO4，5µL5×LAMP引物混合物（附件A），1µL样本悬浮液或上清液，1μLBst2.0DNA聚合酶（8000U/mL）,4μL5M甜菜碱,1µL12.5mMMncl2，1µL0.6μM钙黄绿素，去离子水补足至25µL。LAMP反应条件为:60℃反应60min，80℃5min使酶热变性失活终止反应

7、。3　LAMP检测结果判断LAMP反应结束后，通过观察反应液颜色的变化进行判断。阳性结果颜色为绿色，阴性结果颜色为桔红色。或对LAMP产物进行电泳分析。取3µL反应产物，加入0.5µL6倍上样缓冲液（6×loadingbuffer）,混匀，在2%的琼脂糖凝胶上90V恒压电泳30min,凝胶成像仪扫描拍照进行判断。阳性结果产生梯形条带，阴性结果无条带。4DB36/XXXXX—XXXXAA附　录　A（资料性附录）LAMP检测引物、5×LAMP混合引物配制及反应体系和条件A.1　LAMP检测引物引物名称引物序列

8、长度/bpF35’-CAACACCGGCGATGACTG-3’18B35’-GATCGGTCGCATAGAACGC-3’19FIP5’-GGATCACGTGGTCCTGCGCCGCCATCAAGTCCGGCAAGA-3’40BIP5’-ACGCTCGGCAGCGAGATGTGCGCATCGTCAGGTTG-3’36A.2　5×LAMP引物混合液1mL5×LAMP混合引物配制：引物名称母液浓度加入量混合液中终浓度FIP引物100