DB37T 4044-2020 禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法.doc

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1、ICS 11.220B41     DB37山东省地方标准DB37/T4044—2020     禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法Real-timePCRassayforthedetectionoffowladenovirusserotype42020-07-09发布2020-08-09实施山东省市场监督管理局   发布DB37/T4044—2020前  言本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出并组织实施。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学家禽研究所。本标准主要起草人：孟凯、吴

2、家强、袁小远、宋敏训、张玉霞、杨金兴、艾武、亓丽红。6DB37/T4044—2020禽腺病毒4型荧光定量PCR检测方法1　范围本标准规定了禽腺病毒4型（FAdV-4）荧光定量PCR检测方法。本标准适用于鸡咽喉和泄殖腔拭子及肝脏组织中FAdV-4的检测。2　规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682　分析实验室用水规格和试验方法3　试验原理实时荧光定量PCR检测是在PCR反应体系中，除采用特异的引物外，还加入了与D

3、NA双链非特异性结合的SYBRGreenI荧光染料。当它与DNA双链结合时，发出荧光，从DNA双链上释放出来时，荧光信号急剧减弱。随着PCR反应的进行，每经过一个循环，收集一次荧光强度信号，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。4　试剂或材料除非另有说明，在分析中仅使用分析纯的试剂，水为GB/T6682规定的一级水。4.1　10×磷酸盐缓冲液PBS：pH值7.2。4.2　研钵。4.3　病毒DNA提取试剂盒。4.4　SYBRGreenIqPCR混合物。4.5　阳性对照：浓度为1.0×105拷贝/μL的阳性质粒。4.6　阴性对照

4、：水。4.7　DEPC水。5　仪器设备5.1　微量可调移液器：最大量程为10μL、20μL、100μL、1000μL。5.2　台式低温高速离心机：最高转速16000r/min。5.3　分析天平：精度为0.01g。5.4　荧光定量PCR仪：温度范围4.0℃～99.9℃。5.5　冰箱：规格为4℃和-20℃。5.6　二级生物安全柜。6DB37/T4044—20201　引物P1：5’-GTCTATACCAACACGAGCACC-3’P2：5’-TTTTGTACCCGTCGCAGAG-3’2　样品2.1　采集工具棉拭子，剪刀，镊子，1.5mL离心管。2.2　样品采集

5、2.2.1　咽喉拭子/泄殖腔拭子2.2.1.1　咽喉拭子采样：将棉拭子深入喉头来回刮3次，取咽喉分泌液，放于含抗生素（青霉素2000U/mL+链霉素2mg/mL）的10×磷酸盐缓冲液PBS（pH值7.2）的1.5mL离心管中。2.2.1.2　泄殖腔拭子采样：将棉拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便（需有可见粪便），放于含抗生素（青霉素10000U/mL+链霉素10mg/mL）的PBS中。2.2.2　组织样品待检禽无菌采集整个肝脏，装入一次性采样袋或其他灭菌容器，编号。2.3　样品运输与保存样品放于保温箱中加冰，密封，24h内送至实验室，如不能立即检测，需将样品放于

6、-20℃冰箱保存。2.4　样品处理2.4.1　咽喉拭子/泄殖腔拭子将装有咽喉拭子/泄殖腔拭子的1.5mL离心管在振荡器上充分混合后，取出棉拭子，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清液转入新的1.5mL离心管中，编号备用。2.4.2　组织样品将组织置于灭菌的研钵中，按照质量体积比（1：5～10）加入灭菌PBS进行充分研磨，4℃条件下5000r/min离心10min，取上清液转入新的1.5mL离心管中，编号备用。3　试验步骤3.1　病毒DNA提取用病毒DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取待检样品的DNA。病毒DNA提取成功后置于-20℃保存备用。

7、3.2　荧光定量PCR反应体系详见表1。6DB37/T4044—2020表1　荧光定量PCR反应体系试剂使用量SYBRGreenIqPCR混合物*10μLPCRForwardPrimer(10μmol/L)1μLPCRReversePrimer(10μmol/L)1μLDNA模板2μLDEPC水6μLTotal20μL每次均应设阴性对照。*内含DNA聚合酶，dNTPMixture，Mg2+和荧光染料SYBRGreen。1.1　荧光定量PCR反应程序设定详见表2。表2　荧光定量PCR反应程序设定阶段1：预变形阶段2：PCR反应阶段3：溶解曲线分析95℃，1m

8、in95℃，5sec95℃，5sec60℃，45sec（收集荧光）