生命科学综合实验报告zz.doc

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1、生命科学综合实验报告名称：绿色荧光蛋白基因的原核克隆与表达姓名：蔡晓丽班级：生082-1学号：1组别：一组实验台号：一指导教师：曾勇实验日期：2011/11/14—2011/11/17同组成员：张瀚林严凤莲许慧孙伟伟绿色荧光蛋白基因的原核克隆与表达一实验目的1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。二实验原理pET原核表达系统,目的基因被克隆到pET质粒载体上

2、，受T7启动子控制；T7启动子受宿主细胞编码的T7RNA聚合酶控制；宿主T7RNA聚合酶基因位于乳糖操纵子中，具有可调控性。将外源基因克隆在含有T7启动子的pET23b(+)表达载体中，让其在E.coli(BL21DE3)中表达。先让宿主菌生长，然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖)或乳糖，（IPTG与乳糖操纵元的阻遏蛋白结合，使乳阻遏蛋白的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，）使宿主菌染色体上的LacUV5启动子指导的T7RNA聚合酶基因转录

3、，再与表达载体上的T7启动子结合，启动表达载体上外源DNA基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE检测。三实验仪器与试剂仪器：超净工作台、PCR仪、核酸电泳设备、灭菌锅、培养箱、恒温摇床、微量移液器、核酸蛋白图像分析仪、离心干燥仪、低温离心机、常温台式离心机、微量分光光度计、水浴锅、微波炉、金属浴、涡旋仪、掌中宝离心机等试剂：质粒提取试剂盒、DNA回收试剂盒、高效感受态制备试剂盒、T4连接酶、NheI、XhoI、Taq酶、氨苄青霉素（Amp）、IPTG、Goldview、核酸分子量标准、核酸电泳试剂、细菌培养用培养基四实验步

4、骤第一天一、实验药品的配制1根据LB培养基的配方如下:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L；酵母提取物(Yeastextract)5g/L，氯化钠(NaCl)5g/L另外根据经验值用NaOH调节该培养基的pH，使其达到7.4，固体培养基加入琼脂粉20g/L。2含AmpLB固体培养基的配制：准备500ml锥形瓶1个，配制LB固体培养基250ml。121℃灭菌20min。待培养基冷至60℃左右（以不烫手背为标准），加入Amp(50mg/ml)300μl至终浓度为60μg/ml，倒平板备用。3液体LB培养基的配制：配制LB液体培养基100m

5、l：410×TBE（89mMTris碱，89mM硼酸，2mMEDTA）Tris碱加108g，硼酸加55g，Na2EDTA·2H2O加7.44g，水加至1000ml5、牙签，枪头、（1.5ml，10ml）离心管、PCR管等灭菌，准备试管20个，每支分装5ml。121℃灭菌20min，备用（老师准备）二PCR反应体系准备20μl反应体系：（每组3份）上游引物（2μM）：2μl下游引物（2μM）：2μldNTP（2.5mM）：2μl10×buffer：2μlMgCl2：1.2μlTaq酶(5u/μl)：0.4μl模板：1μl水：9.4μl按上

6、述体积比例用不同规格移液枪按体积数由大到小依次添加到放入PCR仪里设定反应条件反应3-4小时。三琼脂糖凝胶电泳测PCR反应产物浓度称取0.16g琼脂糖，加入16ml0.5×TBE缓冲液，微波炉加热融化。稍冷后加入1μlGoldview，倒胶，室温冷却15-20min。2、每5μlPCR产物中加入1μl6×loadingbuffer，上样，电泳。3、核酸蛋白图像分析仪上观察电泳结果，目的基因约750bp。三、双酶切、用微量分光光度计分别测定PCR产物和表达载体pET23b的浓度。2、双酶切：GFP的双酶切位点是NheI与XhoI，其中Nh

7、eI在bufferM中的酶切活力最高，而XhoI在bufferH中的酶切活力最高。NheI2ul10倍bufferM5ulDNA10．3ulH2O32.7ul37℃摇床上进行酶切待反应6h左右Tris-cl2ulNaCl1.25ulXhol1ul加入以上成分调至bufferH，这样便达到XhoI酶的最适缓冲液浓度，然后放回37℃摇床上进行酶切，过夜。原核表达载体pET23b（1ug）同GFP双酶切步骤一样第二天一、酶切片段的回收及连接1、酶切样品的纯化：（小量DNA产物纯化试剂盒ZP201-2，北京庄盟）①PCR反应结束后，将PCR产物

8、移至干净的1.5ml离心管中，加入5倍体积的结合液混匀。其它酶切样品也照同样比例加入。②将混合液转移到收集管内的吸附柱中，室温放置2分钟。12,000rpm室温离心1分钟。③取下吸附柱，倒掉收集管中的废液，