基因工程实验指导书.doc

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1、实验项目重组质粒DNA的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测实验项目类型:综合性所属课程名称:《基因工程》实验计划学时:8学时一、实验目的学会最常用的小量制备质粒DNA的碱裂解方法。学会用酶切法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。二、实验原理1、提取质粒原理根据共价闭合环状质粒DNA与线性DNA在拓扑学上的差异来分离。在pH12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性DNA双螺旋结构解开而被变性。尽管在这项的条件下共价闭合环状质粒DNA也会变性,但两条互补链彼此互相盘绕,仍会紧密结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲

2、液使pH恢复中性时,共价闭合环状质粒DNA复性快,而线性的染色体DNA复性缓慢,经过离心与蛋白质和大分子RNA一起沉淀下去。2、质粒DNA的酶切鉴定原理利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。三、实验材料与仪器 1、仪器超净工作台,接种环,酒精灯,台式离心机,旋涡混合器,微量移液取样器,1.5ml微量离心管,恒温摇床,摇菌试管,双面微量离心管架,试管架,标签纸,磁力搅拌机。2、试剂pGEM-T-AT8载体菌,LB培养基1000

3、ml(含100ug/ml氨苄青霉素),葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液(溶液I),NaOH/SDS溶液(溶液II),KAc溶液(pH4.8)(溶液III),RNaseA,95%乙醇,70%乙醇,TEbuffer(pH8.0)。EcoRI,XbaI,SacI,XhoI,内切酶缓冲液(10×),10×电泳加样缓冲 四、操作步骤1、实验准备氨苄青霉素储存液(无菌水配制5mg/ml,分装后-20°C保存),配制LB培养基(胰化蛋白胨10g,酵母提取物5g,NaCl10g加200mLddwater搅拌完全溶解

4、,用约200mL5NNaOH调pH至7.0,加ddwater至1L,121°C20min灭菌);溶液I(50mmol/L葡萄糖,25mmol/LTrisHClpH8.0,10mmol/LEDTApH8.0);溶液II(0.2mol/LNaOH,1%SDS);溶液III(60mL5mol/LKac,加冰乙酸调pH4.8,补ddwater至100ml),70%乙醇(-20°C保存),TEbuffer(10mmol/LTrisHClpH8.0,1mmol/LEDTApH8.0);10mg/mLRNaseA(RNA

5、酶A溶于10mmol/LTrisHClpH7.5,15mmol/LNaCl中);摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5ml离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒,一起高压灭菌(121°C30min)。2、操作步骤1)制备质粒DNA(1)在超净工作台中取5mlLB(Amp+),加入灭菌的摇菌管中。(2)从超低温冰箱中取出保存pET-his载体的菌种和pGEM-T-AT8载体菌种(挑白色克隆!),在超净工作台上用烧红的接种环刮一下,再把接种环于无菌LB培养液(含100ug/ml氨苄青霉素)中搅拌一下,37°C

6、摇床中摇20h。(3) 取1.5ml的菌液于1.5ml离心管中,15000rpm离心1min,弃上清液(尽量弃干净),留沉淀备用。(4)  在沉淀中加入预冷的100ml溶液I,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀,室温下静置5min。(等待的同时,取一个塑料盒,装上适量的冰块备用。)(5)   加入200ml溶液II,盖上盖后上下颠倒几次混匀,插入冰中,放置5min。(6)  加入150ml预冷的溶液III,盖上盖后上下颠倒几次混匀,插入冰中,放置5min。(7)  15000rpm离心5min,小心吸取400m

7、l上清液于另一个干净的1.5ml离心管中,(不要将白色沉淀物带入!),加入800ml95%乙醇,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀,室温下静置5min。(8)  15000rpm离心10min,小心弃掉上清液,加入500ml70%乙醇,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min,小心弃掉上清液,尽量倒置弃干净(9)   再加入500ml70%乙醇,盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。15000rpm离心10min,小心弃掉上清液,尽量倒置弃干净(10) 离心管倒置于37°C培养箱中(或室温)空气

8、干燥。(管底的沉淀质粒DNA用肉眼几乎看不见!)。(11)  加入30ml无菌蒸馏水或TE缓冲液;3管pET-his质粒中每管加入10ml蒸馏水混匀后收集到一个管中,涡旋混合器上混匀,在离心机中瞬时转一下,使溶液集中在管底。待电泳确认(见实验二)后再在pET-his质粒中加入1mlRNaesA。用记号笔标记后放入冰箱中备用。(12)电泳检测2)酶切(1)混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中:pGEM-T

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