窖池发酵过程中酒醅内酵母菌的分离与分类统计.doc

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1、...论文论文题目：窖池发酵过程中酒醅酵母菌的分离与分类统计作者：单位：2011年7月.......摘要:白酒的生产以泥窖窖池为基础，窖池中的多种微生物，特别是栖息于酒醋中的微生物左右着酒的产量和品质。酵母菌同时起着发酵酒精和产生香味物质的作用，是窖池发酵三大菌群之一，它们在发酵过程中的消长情况值得关注。本研究分别选取本厂南车间的一口窖池以及北车间的两口窖池作为分析对象。分别从原料入窖到出窖蒸馏进行全程跟踪采样，采样方法如下：按发酵0天(入窖)、7天、14天、2l天、28天、49天、70天(出窖)的时间点取样

2、7次；每次共计6个空间区域，即窖池酒醅按纵向分上中下三层，每一层分中心区域和周边区域，同区域取3点样混合均匀；7次取样共获36个样品(入窖和出窖样只有上中下3个样品)。首先，采用传统的分离技术对每份样品进行平板计数，以便分析在各个窖池发酵过程中不同取样位置酵母菌数量的变化情况；然后采用常规的鉴定方法对分离到的菌株进行鉴定，以探讨发酵过程中存在的优势菌群；最后，采用18SrDNA序列分析方法，验证常规鉴定结果的准确性，并对各菌属进行系统发育分析。关键词：窖池发酵酵母数量消长优势菌群系统发育浓香型白酒窖池发酵过程

3、中酵母类微生物的分析绪长期以来，微生物的平板分离计数法(即活菌计数法，CFU法)一直是我国科研工作者研究窖池微生物区系的重要手段。本法将样品用无菌生理盐水进行系列稀释，取合适的稀释度(一般三个稀释度)，以涂布法接种于平板，或以混碟法进行操作，经过一定时间的培养之后，直接统计平板的菌落。该方法测定的是样品中所含的现时可培养的活的微生物数量，所以称之为活菌计数法。平板分离计数法中，每个菌落由一个单细胞繁殖而成，为肉眼可见的细胞群体，一般来说在每个平板形成30～300个菌落属于有效围，该法所测数值有可能偏低，因为有

4、可能两个或以上的单细胞在一起形成一个菌落，也可能培养条件不适。平板分离计数法仅能对可培养微生物进行统计且存在一定的偏差，虽然有其一定的缺陷性，但它可以得到活的菌落培养物，再通过纯化分离可得到纯种的微生物培养物，更全面地保留了特定微生物的信息，这是当前微生物分子生态学技术所不能做到的。材料与方法1实验材料1.1样品来源1.1.1分离培养基选择用样品采自南车间一窖池的出窖糟醅。1.1.2分析样品选取本厂南车间的一个窖池，以及北车间的两个窖池分别进行跟踪采样，采样方法如下：按发酵0天(入窖)、7天、14天、21天、

5、28天、49天、70天(出窖)时间点跟踪取样7次；每次共计6个空间区域，即窖池酒醅按纵向分上中下三层(窖顶以下50-75cm，150-175cm，250-275crn)，按横向分中心区域(中心区75cm以)和周边区域(距窖顶各边5．20cm环带)，同区域取3点样进行混合平均；7次取样共获36个样品(入窖和出窖样只有上中下3个样品)。1.2培养基.......1.2.1酵母分离用培养基1.2.1.1YPD培养基[4]葡萄糖20g蛋白胨20g酵母膏10g琼脂20g蒸馏水100ml113℃灭菌30rain1.2.1

6、.2米曲汁培养基[5]米曲汁培养基的制法：1)将干米曲磨碎，一份米曲加四份水。在65℃水浴锅中糖化3～4h，糖化程度可用碘滴定之。2)将糖化液用4～6层纱布过滤，滤液如混浊不清，可用及蛋白澄清。方法是将一个鸡蛋白加水约20ml，调匀至泡沫时为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后在过滤。3)将滤液稀释到5～6波美度，PH约6.4，加入2%琼脂。121℃灭菌20min1.2.1.3麦氏琼脂培养基[4]葡萄糖1gKCl1.8g酵母浸膏2.5g醋酸钠8.2g琼脂20g蒸馏水1000ml113℃灭菌20min1.2.2酵母鉴

7、定用培养基[6]麦芽汁液体培养基：将麦芽汁调至lO波林的糖度，pH至5.4；过滤后分装试管，每管4ml；113℃灭菌20min。麦芽汁固体培养基：以10波林麦芽汁，加2%琼脂，加热熔解，分装试管；113℃灭菌20min；摆斜面。McClary培养基：葡萄糖0.1%，KCl0.18%，酵母膏0.25%，醋酸钠O.82%，琼脂2%，用蒸馏水配：装试管；113℃灭菌15min：搁黄斜面。Kleyn培养基：KH2P040.012%，K2HP040.02%，醋酸钠0.5%,葡萄糖0.062%，NaCl0.062%，蛋白

8、胨O.25%，水洗琼脂2%，生物素2.O微克%，每100ml加混合盐类lml，蒸馏水配，pH6.9～7.1；装管；113℃灭菌20min；搁置斜面。混合盐溶液：MgSO4·7H20O.4%，NaClO.4%，CuS04·7H200.002%，MnS04·4H200.2%，FeS04·4H200.2%。Gorodkowa培养基：葡萄糖0.1%，蛋白胨l%，NaCl12%，水洗琼脂2%，蒸馏水配；装管；