病毒鉴定的方法有哪些.pdf

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1、.病毒鉴定的方法有哪些？从培养的细胞中分离病毒，然后采用免疫荧光和分子生物学技术进行病毒核酸检测已被成功地用于病毒的鉴定。目前最常用的病毒定量检测方法有以下三大类：用于病毒感染力检测的技术，如病毒空斑形成试验，半数组织培养感染剂量TCID50测定和免疫荧光等；病毒核酸和病毒蛋白检测技术，如实时定量多聚酶链反应（qPCR），免疫印迹，免疫沉淀，酶联免疫吸附测定（ELISA）和血凝试验等；还有就是那些直接对病毒颗粒进行计数的方法，如流式细胞分析或透射电镜技术。病毒检测方法的局限性病毒鉴定方法1.培养细胞的显微学观察材料和仪器细胞生长培养基：含10%FBS(胎牛血清),4-6mMGlutamin

2、e（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等维持培养基：上述新鲜的细胞培养基，但血清FBS浓度减少至为2%宿主细胞：铺满单层细胞的8孔培养腔室玻片（chamberslides）PBS磷酸缓冲液Bouin's固定液吉姆萨（Giemsa）缓冲液吉姆萨（Giemsa）染色液丙酮，丙酮：二甲苯（2:1），丙酮：二甲苯（1:2），二甲苯中性树胶移液枪头(10到100微升)移液管生物安全柜（超净台）二氧化碳培养箱倒置显微镜...实验方案接种宿主细胞至ChamberSlides：选择合适的细胞接种密度（比如8-孔ChamberSlides，接种30,000细胞/孔

3、），培养基为细胞生长培养基（10%FBS-DMEM）。轻轻地前后左右摇晃chamberslides使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜，第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。制备不同稀释度的病毒液：标记6支无菌离心管，第1管加入990μl细胞生长培养基，剩下5管加入900μl细胞生长培养基。按以下方法进行梯度稀释：在第1管中加入10μl病毒原液（稀释度1:100）充分混匀，然后从第1管吸100μl至第2管中混匀，依次类推，进行10倍梯度稀释。管1至管6的稀释度分别为10-3到10-7。感染细胞：吸去培养孔中的培养液，每孔加入0.5mL维持培养液（2%FBS

4、-DMEM），再加入100μl不同稀释度（10-2至10-7稀释）的病毒液至其中一孔，留一孔不加作为空白对照。将细胞置二氧化碳培养箱37oC或34oC培养1-4周，追踪观察致细胞病变效应（CPE）发生情况。吉姆萨染色：一旦观察到细胞病变效应，轻轻地用PBS将细胞洗3次，每次5min，然后加入Bouin's固定液固定10min。用吉姆萨缓冲液洗3次，然和加入Giemsa染液染色1h，再用吉姆萨缓冲液清洗后依次用丙酮处理15s，2:1的丙酮-二甲苯处理30s，1:2的丙酮-二甲苯处理30s，最后用二甲苯处理10min紧接着用中性树胶封片。显微镜下观察CPE，包涵体，细胞融合及病毒空泡形成情况。

5、病毒感染细胞后形成的CPE图片范例可以在很多图谱，网站和博客上找到，例如ASMMicrobeLibrary2.免疫荧光(IF)检测方法材料和仪器细胞生长培养基：含10%FBS(胎牛血清),4-6mMGlutamine（谷氨酰胺）的高葡萄糖DMEM，若有需要可加入青霉素，链霉素，庆大霉素，两性霉素等宿主细胞：铺满单层细胞的8孔培养腔室玻片（chamberslides）PBS磷酸缓冲液一抗FITC标记的二抗细胞核染料DAPI5-4%多聚甲醛（PFA，pH7.4），或者甲醇移液枪头(10到100微升)离心管生物安全柜（超净台）二氧化碳培养箱荧光显微镜实验方案接种宿主细胞至ChamberSlide

6、s：选择合适的细胞接种密度（比如8-孔ChamberSlides，接种30,000细胞/孔），培养基为细胞生长培养基（10%FBS-DMEM）。轻轻地前后左右摇晃chamberslides使细胞分布均匀。将细胞置培养箱培养过夜，第二天，显微镜下观察细胞确认细胞是否分布均匀并达到80%以上的融合度。病毒感染：每孔细胞加0.1mL病毒储存液，留一孔不加作为阴性对照。将细胞放回CO2培养箱，37°C或34°C培养48h。...免疫荧光染色观察：病毒感染48h后，吸去培养液，将细胞用预冷的甲醇固定5min（也可用新鲜制备的4%多聚甲醛固定）后，用含0.2%tritonX的PBS室温破膜5min。将

7、细胞用PBS清洗后，加入推荐浓度的一抗孵育2h，PBS清洗5遍，然后再加入荧光（Alexafluor488或FITC）标记的二抗进行孵育，PBS清洗5遍，加入DAPI染细胞核，在相差及荧光显微镜下观察结果。3.分子学方法用实时定量逆转录PCR（Real-timeRT-PCR）来检测流感病毒比终点检测方法更为快捷，且敏感度跟细胞培养法相当甚至更佳用分子技术从临床样本中直接对病毒基因组进行鉴定是21世纪的重大发现之一。核酸扩