第十二章 核酸探针检测技术.docx

《第十二章 核酸探针检测技术.docx》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、现代食品检测技术第二部分第12章核酸探针检测技术赵杰文邹小波江苏大学食品与生物工程学院第十二章核酸探针检测技术1核酸探针的种类及其制备方法2探针标记物与标记方法3探针杂交与信号检测4核酸探针在食品微生物检测中的应用1核酸探针的种类及其制备方法一、基因组DNA探针二、cDNA探针三、RNA探针四、寡核苷酸探针一、基因组DNA探针这类探针多采用分子克隆或PCR技术从基因文库筛选或扩增方法制备。二、cDNA探针cDNA探针是以RNA为模板，在反转录酶的作用下合成的互补DNA，因此它不含有内含子及其他非编码序列，是一种较理想的核酸探针。三、RNA探针mRNA作为核酸分子杂交的

2、探针是较为理想四、寡核苷酸探针用人工合成的寡聚核苷酸片段作为分子杂交的探针，其优点是可根据需要随心所欲地合成相应的序列，避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响2探针标记物与标记方法一、核酸探针标记物种类及其特点二、探针标记方法三、探针的纯化四、探针标记效率的评估一、核酸探针标记物种类及其特点标记探针的目的是为了跟踪探针的去向，确定探针是否与相应的基因组DNA杂交一、核酸探针标记物种类及其特点一种理想的探针标记物，应具备以下几种特性：1、高度灵敏性；；2、标记物与核酸探针分子的结合；；3、应不影响探针分子的主要理化特性；4、当用酶促方法进行标记时，应对酶

3、促活性(Km值)无较大的影响；5、检测方法除要求高度灵敏性外，还应具有高度特异性二、探针标记方法（一）探针的放射性核素标记法（二）探针的非放射性标记法（一）探针的放射性核素标记法1．缺口平移法2．随机引物法3．单链DNA探针的标记4．cDNA探针的标记5．寡核苷酸探针的标记缺口平移法（二）探针的非放射性标记法1．PCR标记法2．体外转录标记RNA探针PCR标记法体外转录标记RNA探针三、探针的纯化（一）凝胶过滤柱层析法（二）反相柱层析法（三）乙醇沉淀法四、探针标记效率的评估通过测定标记产物的量来估计每一次标记反应的效率，这可以准确了解杂交液中应加探针的量。估计探针产量

4、的推荐方法估计探针产量的推荐方法3探针杂交与信号检测一、核酸杂交二、杂交信号检测一、核酸杂交（一）Southern印迹杂交（二）Northern印迹杂交（三）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交（四）原位杂交Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点印迹杂交和狭线印迹杂交（三）斑点印迹杂交和狭线印迹杂交斑点印迹杂交（dotblotting）和狭线印迹杂交（slotblotting），是在Southern印迹杂交的基础上发展的两种类似的快速检测特异核酸（DNA或RNA）分子的核酸杂交技术。原位杂交1975年，M.Grunstein和D.Hogness根据检测重组体DNA

5、分子的核酸杂交技术原理，对Southern印迹技术作了一些修改，发展出了一种菌落杂交技术。二、杂交信号检测（一）放射性核素探针的检测－放射自显影（二）非放射性核素探针的检测（一）放射性核素探针的检测－放射自显影利用放射线在×线片上的成影作用来检测杂交信号，称为放射自显影。（二）非放射性核素探针的检测1．偶联反应2．显色反应1．偶联反应大多数非放射性标记物是半抗原，因此可以通过抗原—抗体免疫反应系统与显色体系偶联。另一类非放射性标记物如生物素，作为抗生物素蛋白(avidin)的配体，则可通过亲合法进行检测。2．显色反应通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质(如酶、荧光

6、素等)进行杂交信号的检测。4核酸探针在食品微生物检测中的应用一、大肠杆菌二、金黄色葡萄球菌三、李斯特氏菌四、存在的问题及展望一、大肠杆菌放射性同位素标记的核酸探针正越来越多地用于ETEC的快速检测二、金黄色葡萄球菌法国生物梅里埃公司的GEN—PROBE系统，采用杂交保护分析法(HPA)研制成金黄色葡萄球菌检验和鉴定试剂盒，已成功应用于检测食品中的金黄色葡萄球菌。三、李斯特氏菌生物梅里埃公司的“AccuprobeListeriamonocytogenes”和GENE-TRAK的“GENE-TRAKListeria”。四、存在的问题及展望核酸探针技术虽为一种快速、敏感、特

7、异的检测新技术，但其在实际应用中仍存在不少问题。放射性同位素标记的核酸探针具有半衰期短、对人体有危害等缺点，作为常规诊断，特别是在食品检验实验室很不适用。