病毒检验技术.ppt

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1、第十七章病毒检验技术本章内容第一节标本的采集、处理与运送1第二节病毒的分离与鉴定2第三节病毒学检测及诊断3学习目标及重点学习目标：掌握病毒标本采集和送检应遵循的原则；病毒检验鉴定常用技术熟悉病毒血清学诊断常用的方法了解病毒感染的实验室快速诊断学会病毒的培养基本操作本章重点：★病毒标本采集和运送原则。★病毒学诊断及鉴定常用方法。★病毒培养的基本操作。病毒学检验技术是用实验室检验方法对临床和流行病学现场送检的标本（如人或宿主的血液、组织、尿、粪便和组织液等）进行病毒学的定性和定量分析，为病毒感染和病毒性疾病的诊断、治疗和预防提供科学依据。检验程序包括标

2、本的采集、分离培养鉴定、快速诊断。第一节标本的采集、处理与运送一、标本的采集与处理1.采集时间：发病早期或急性期尽快采集。很多急性病毒感染，症状出现前病毒已经开始释放，症状初期病毒量即迅速达到峰值，之后平缓下降至疾病痊愈，不过也有例外。第一节标本的采集、处理与运送一、标本的采集与处理2.采集部位：取决于临床症状和所怀疑感染的病毒。从病原体入侵部位取材从病原体感染的靶器官取材根据病原体的排泄途径取材从环境中采集标本如：流感病毒感染------鼻咽拭子乙型脑炎病毒感染------脑脊液轮状病毒感染------粪便乙型肝炎病毒感染------血液第一节标

3、本的采集、处理与运送一、标本的采集与处理3.采集方法与处理提高病毒的分离率，防止标本污染。采集时无菌操作,可加入抗生素以杀死杂菌二、标本的运送与保存1.标本的运送尽快送检冷冻、冷藏运输防漏、专人、标记2.标本的保存-70℃可较长时间保存可加入甘油或二甲基亚砜（DMSO）、Hanks液或小牛血清等以防病毒失活第一节标本的采集、处理与运送不同的病毒分离时采用不同的分离方法,这主要取决于目的病毒的生物学特性。主要有细胞培养法、鸡胚培养法、动物接种法等,而对细胞、鸡胚不敏感,又没有合适动物模型的病毒,可采用基因克隆的方法。第二节病毒的分离与鉴定一、病毒的分

4、离培养2.鸡胚培养第二节病毒的分离与鉴定原代细胞培养二倍体细胞培养传代细胞羊膜腔接种尿囊腔接种卵黄囊接种绒毛尿囊膜接种组织细胞培养鸡胚培养动物接种是将离体活组织块或分散的组织细胞加以培养的技术总称，为病毒分离鉴定中的最常用的基本方法。（一）组织细胞培养鸡成纤维细胞Hep-2细胞细胞培养瓶Vero细胞第二节病毒的分离与鉴定1.原代细胞原代细胞是指从机体取出后立即培养的细胞。原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。2.二

5、倍体细胞是指原代细胞在体外分裂50代以后仍能保持其二倍染色体数目。二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗等。3.传代细胞传代细胞来源于肿瘤细胞或细胞株传代过程中变异的细胞称为传代细胞，它们能在体外无限期地传代。大多是肿瘤细胞或突变的二倍体细胞。常用的传代细胞株有Hela细胞（人宫颈癌细胞），Hep-2（人喉上皮癌细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）等。152.鸡胚培养第二节病毒的分离与鉴定鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法，此方法可用以进行多种病毒的分离、培养，毒力的滴定，中和试验以及抗原和疫苗的制备等。1

6、6一般选用9～14d的鸡胚来源充足、组织分化程度低、本身很少携带病毒和细菌、对接种病毒不产生抗体及病毒较易增殖等2.鸡胚培养优点：第二节病毒的分离与鉴定选择不同的接种部位是病毒分离成功的关键常用的主要有：尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种2.鸡胚培养第二节病毒的分离与鉴定不同病毒在鸡胚的不同部位的生长特性差异很大2.鸡胚培养尿囊腔接种羊膜腔接种尿囊腔羊膜腔常用接种途径：尿囊腔接种、羊膜腔接种、卵黄囊接种、绒毛尿囊膜接种常用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的适应和传代培养常用于临床流感病毒初次分离第二节病毒的分离与鉴定卵黄囊接

7、种绒毛尿囊膜接种卵黄囊绒毛尿囊膜人工气室羊膜腔气室绒毛尿囊膜尿囊腔卵白2.鸡胚培养主要用于虫媒病毒、衣原体及立克次体的分离和繁殖。常用于牛痘病毒、天花病毒、单纯疱疹病毒的分离卵黄囊第二节病毒的分离与鉴定3.动物接种常用的实验动物有小白鼠、乳鼠、豚鼠、家兔、猴和鸡等常用的接种途径包括皮下、皮内、腹腔、静脉、角膜、鼻腔及脑内接种等方式第二节病毒的分离与鉴定二、病毒增殖的观察（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标1．细胞形态的改变2．红细胞吸附3．细胞培养液pH值改变（二）病毒数量及病毒感染性测定1．血凝试验2．中和试验3．空斑形成试验4．半数感染量（ID50

8、）和组织培养半数感染量（TCID50）第二节病毒的分离与鉴定二、病毒增殖的观察（一）病毒在细胞内增殖的鉴定指标1．细胞形态