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1、原代神经细胞培养取孕12天SD大鼠戊巴比妥纳腹腔注射麻醉.取胎鼠,75%酒精消毒5到10分钟,撕开颅骨取出全脑至盛有D-Hanks液的培养中反复冲洗以去除血污,并剥离脑膜二再把全脑转人盛有预冷D-Hanks液的培养皿中,在解剖镜下切取中脑腹侧部位组织,以眼科弯剪剪成lmm3大小,分别转入两个盛有无血清培养液的25ml培养瓶中,一瓶以胰酶37℃孵育20min再以硅化的弯头吸管吹打;另一瓶直接以硅化的内口外翻的弯头吸管轻轻吹打至培养液呈均匀浑浊.其间可在倒置显微镜下观察细胞离散程度。分别将细胞悬液转移至消毒离心管中,配
2、平，800r/min离心10分钟。再加定量含血清DMEM/F12混合培养液制成细胞悬液.调节细胞密度到6x107/ml,接种入2个预先多聚赖氨酸铺底的六孔板中,置于培养箱,37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养。2中脑神经元纯化细胞培养24h后,两组均换含阿糖胞甘以5mol/l的培养液抑制神经胶质细胞等非神经细胞的生长,以后每48小时换液，培养液为无血清的DMEM/F12混合培养液。3酪氨酸经化酶TH免疫细胞化学染色法鉴定细胞培养7天,弃去培养液,经4%多聚甲醛固定30min,采用免疫细胞化学法染色鉴定神经元类型,
3、先用小鼠抗大鼠TH单克隆抗体(l:50稀释)为一抗,以生物素化羊抗小鼠抗体(即用型)为二抗,以1：500为底物进行ABC法免疫细胞化学染色,倒置显微镜下控制显色时间。.4TH免疫阳性细胞形态观察TH免疫反应神经元占全部培养细胞的比例在倒置显微镜下,从对照组(胰酶消化组)及实验组(直接吹打组)中分别随机选取30个视野(250X),计数视野中TH免疫阳性细胞及全部培养细胞,计算TH免疫阳性细胞占全部培养细胞的比例。5神经突起长度的测量在上述视野中,以倒置显微镜标配软件上的标尺为工具,测量多巴胺能神经元突起的长度。对于各
4、种形态的神经元,均测量其最长的突起。两组各计总长,除以总数,分别得到每组多巴胺能神经元突起的平均长度。方法细胞培养及绘制生长曲线胚胎中脑祖细胞的培养参照Yu等[1,2]方法并适当修改,简述如下,E12孕鼠以乙醚麻醉后腹部消毒,剖腹取出子宫置于10cm的消毒玻璃培养皿中;剪开子宫取出胚囊,用镊子撕破羊膜囊取出长约6~8mm(顶臀径)的胚胎,置入另一盛有D-Hanks液的玻璃皿中;在解剖显微镜下切取中脑曲,切开中脑导水管腹侧,切取中央约的中脑腹侧部分,置入约含0.5mL取材液(2:1的DMEM/F12、2g/L碳酸氢钠
5、、20g/LB27、10g/LN2、0.2g/LDNase)的1.5mL的EP管中,分别用1mL和0.2mL的枪头反复吹吸15次;静置3min,去除沉淀,依胚胎数量加入1~5mL培养液(2:1的DMEM/F12、2g/L碳酸氢钠、20g/LB27、10g/LN2、10mL/LFBS、20μg/LbFGF、100μmol/LAA-2P),玻璃移液管吹吸分散悬浮细胞。取10μL细胞悬液加入10μL4g/L台盼蓝溶液,充分混匀后倒显微镜下计数并判定活细胞比例;调整细胞悬液密度至3*108/L,部分接种在预先用多聚赖氨酸包
6、被的25cm2培养瓶中,每个培养瓶中加入3mL细胞悬液。部分接种在用多聚赖氨酸包被的2个24孔培养板中,其中1个24孔板放置用多聚赖氨酸包被的玻璃爬片,另一个不放,每孔中加入500μL细胞悬液,370C、50mL/LCO2细胞培养箱中培养24h,细胞贴壁后吸除全部培养液,重新加入无血清培养液(2：1的DMEM/F12、2g/L碳酸氢钠、10g/LN2、20μg/LbFGF、100μmol/LAA-2P)继续培养,隔天更换半量培养液。细胞培养5d后吸除全部培养液,换培养液(Neurobasal、20g/LB27、10
7、mL/LFBS、100μmol/LAA-2P、9g/L谷胺酰胺),隔天更换半量培养液继续培养4d。接种在培养板中的细胞爬片在第5、7、9天取出分别用于免疫组化、免疫荧光鉴定。接种在24孔板中的细胞在第2、4、7、9天接种分别随机取6孔,加入25g/L胰酶消化,吹打成单细胞悬液,台盼蓝计数,计算平均每孔细胞数并记录,绘制原代培养细胞生长曲线。在培养瓶中细胞于第10天换液,并加入终浓度为7μmol/L的阿糖胞苷,培养2天后吸除培养液后加人3mLD-Hanks液漂洗2次后加入12.5g/L胰酶,倒置显微镜下观察细胞分散悬
8、浮情况,约8~10min后加人100mL/LFBS终止消化:继续用玻璃移液管吹吸分散细胞,细胞悬液收集人1．5mLEP管中,40C下1500r/min离心3min;弃去上清液,加入培养液(Neurobasal、20g/LB27、50mL/LFBS、50mL/L马血清、100μmol/LAA-2P、9g/L谷胺酰胺)调整细胞悬液密度至2*108/L,在放置用多
