实验课：细菌鉴定技术ppt课件.ppt

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1、细菌鉴定技术苏州大学附属第二医院周惠琴实验内容实验材料2实验目的实验步骤实验结果一、实验目的掌握鉴别细菌常用生化反应试验的原理、结果判读和应用了解数字编码鉴定技术（API条）的原理和结果判读以及细菌数字编码技术操作和临床意义实验内容（一）凝固酶试验原理：方法：试管法取无菌试管2支，各加12滴无菌生理盐水和4滴正常人混合血浆，接种被检菌和阳性对照菌（金黄色葡萄球菌标准菌株），于35℃孵育。结合凝固酶（玻片法）葡萄球菌菌游离凝固酶（试管法）纤维蛋白纤维蛋白原凝集/凝固结果：和对照管相比，发生凝固为阳性，反之阴性。（二）糖发酵实验原理不同种类细菌含有发酵不同糖（醇、苷）类的酶，对各

2、种糖（醇、苷）类的分解能力也有所不同，有的不分解，有的分解仅产酸，有的分解产酸产气，根据生化反应管的不同加不同指示剂会有不同的颜色反应，从而鉴别细菌。方法无菌操作将待测菌接种至糖生化小导管，35℃培养18-24h。结果阳性反应为黄色（指示剂为酚红），不分解糖则无变化。（三）葡萄糖O/F试验原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型；能进行无氧降解的为发酵型；不分解葡萄糖的细菌为产碱型。发酵型细菌无论在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，而氧化型细菌在无氧环境中则不能分解葡萄糖。培养基：葡萄糖发酵管方法：无菌操作将待测菌接种两支葡萄糖生化管，其中一支加无菌石蜡油

3、，高度不小于1cm，35℃培养18-24h。结果：发酵型——两管均变黄氧化型——仅未加石蜡油管变黄产碱型/不分解型——两管均不变色（四）氧化酶试验原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素C氧化，再由氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。试剂：1%盐酸四甲基对苯二胺或1%盐酸二甲基对苯二胺。方法：滤纸法：无菌操作用滤纸沾取待检菌落，用滴管吸取试剂滴于菌落上。试剂纸片法：无菌操作用氧化酶试纸直接沾取待测菌。结果：阳性者立刻出现红色（盐酸二甲基对苯二胺）或蓝色（盐酸四甲基对苯二胺）。阴性不变色。（五）克氏双糖铁

4、（KIA）复合试验原理：KIA斜面培养基，成分葡萄糖：乳糖为1:10,指示剂为酚红,若细菌只分解葡萄糖产酸使PH降低，斜面底层均先变黄，但由于葡萄糖含量少，生成的少量酸接触空气而氧化，又因细菌生成碱性化合物中和，因此斜面又变红，底层仍为黄色；若细菌分解葡萄糖和乳糖，斜面底层均变黄，若产气则有气泡。细菌产硫化氢时与培养基中硫酸亚铁作用生成黑色硫化铁。培养基：克氏双糖铁（KIA）方法：无菌操作用接种针挑取待检菌，先穿刺到底层距管底3-5mm为止，原路退回在斜面自上而下“之”字形划线，35℃培养18-24h.结果：发酵葡萄糖乳糖产酸——斜面底层均变黄发酵葡萄糖不发酵乳糖——斜面红色

5、，底层变黄不发酵葡萄糖和乳糖——斜面底层均红色产硫化氢——底层变黑（六）甲基红-VP试验葡萄糖甲酸乙酸等某些细菌阳性反应：红色甲基红试剂pH<4.5醇，酮等阴性反应：黄色pH>6.2丙酮酸乙酰甲基甲醇二乙酰胍缩二乙酰：红色VP试剂甲、乙（七）枸橼酸盐试验原理：某些细菌能以铵盐为唯一氮源，枸橼酸盐作为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐，使培养基变碱性，指示剂溴麝香草酚兰由淡绿色变为深蓝色。培养基：枸橼酸盐培养基。方法：将被检菌接种于枸橼酸盐培养基，于35℃培养18-24h。结果：阳性—深蓝色阴性—不变色（八）尿素分解试验培养基：尿素培养基方法：将待检菌接种于尿素培

6、养基，于35℃培养18～24h。结果：阳性—变红阴性—不变色尿素尿素分解酶氨红色酚红指示剂pH<7原理（九）硝酸盐还原试验原理：某些细菌能还原培养基中的硝酸盐，生成亚硝酸盐、氨、氮等。一般硝酸盐还原试验测定还原过程中所产生的亚硝酸盐。如培养基中有亚硝酸盐，与醋酸作用生成亚硝酸继而与氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，与α-萘胺结合为红色N-α-萘胺偶氮苯磺酸。培养基：硝酸盐培养基。方法：被检菌接种于硝酸盐培养基中，35℃培养18-24h，加入甲液、乙液，观察结果。结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色反应，可能是：1.硝酸盐没有被还原，试验阴性；2.硝酸盐被还原为氨和氮等其他产物

7、而导致假阴性结果，这时应在试管内加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表示试验为假阴性。（十）苯丙氨酸脱氨酶试验苯丙氨酸脱氨酶苯丙氨酸绿色化合物苯丙酮酸三氯化铁试剂方法：无菌操作将被检菌接种于苯丙氨酸培养基斜面，于35℃培养18～24h，滴加10％三氯化铁试剂3～4滴，自斜面上方流下。结果：出现绿色为阳性三氯化铁试剂（十一）氨基酸脱羧酶试验原理：具有氨基酸脱羧酶的细菌，能分解氨基酸使其脱羧生成胺（赖氨酸→尸胺，鸟氨酸→腐胺，精氨酸→精胺）和二氧化碳，使培养基变碱。使指示剂显示出来