实验原理步骤ppt课件.ppt

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1、2011年分子生物学实验考试安排科学素质：10%实验操作：20%实验结果与报告：40%实验原理与理论：30%科学素质课堂提问原始实验记录团队合作课堂纪律仪器、用具的使用台面整洁考勤卫生值日实验操作1、根据老师的平时观察，2、通过一学期的强调与要求，以最后两次实验的操作为主要评分依据。实验结果与报告根据个人所有实验的结果与实验报告的评分，取平均分。实验原理与理论考试时间：第13周（5月16日-20日）考试地点：本教室考试形式：每个同学按学号单独考试，抽签题目（1+2），口述回答问题，由老师和助教评分。考试内容：1、实验原理步骤：分子克隆总流程+1

2、0次实验原理步骤（共11个题，抽其中1题详细回答）2、实验理论、知识、技巧：实验中的各种小窍门，注意事项，理论知识，操作要点等。（抽其中2题简要回答）实验九蛋白质的诱导表达背景理论知识Section19.1.1实验目的掌握蛋白质诱导表达的原理学习蛋白质诱导表达的方法了解重组蛋白质表达的体系及其有缺点外源基因的高效表达,获得有重要价值的蛋白质产品需将编码所需蛋白的基因插入质粒或其它载体,然后导入活细胞基因工程的最终目的主要步骤制备表达载体制备目的DNA将目的DNA克隆到载体上操作1.酶切,去磷酸化2.胶回收纯化1.质粒纯化/PCR2.酶切3.胶回

3、收纯化1.目的片断与载体连接2.转化非表达型宿主菌3.筛选阳性克隆:菌落PCR,质粒提取酶,测序确定阅读框蛋白表达操作流程转化表达宿主菌诱导优化表达目的蛋白纯化目的蛋白1.转化带有T7RNA聚合酶基因的菌株1.检测质粒稳定性2.确定表达时间和温度的最佳条件3.分析蛋白溶解性和活性4.SDS-PAGE,Western印迹等确定目的蛋白1.放大培养2.制备粗提物3.亲和纯化4.切除融合标签并去除蛋白酶蛋白质表达系统原核表达系统真核表达系统大肠杆菌枯草芽胞杆菌YEASTCELLCULTUREINSECTCELLTRANSFERREDGENE简单,便宜

4、,大量,无修饰复杂,昂贵,有修饰大肠杆菌系统由于遗传学、生物化学、分子生物学方面已被充分了解而成为表达异源蛋白质的首选表达系统。其遗传图谱明确，容易培养且费用低，生产成本低廉。9.1.2原核表达的特点细菌RNA聚合酶不能识别真核基因启动子真核基因mRNA无SD序列，不能启动翻译缺乏转录后加工系统，不能切除内含子,cDNA,表达的蛋白不稳定，容易被细菌蛋白酶破坏缺乏翻译后加工体系不溶性的包涵体在E.Coli中表达重组蛋白功能最强大目的基因受噬菌体T7强转录及翻译信号控制表达由宿主细胞提供的T7RNA聚合酶诱导充分诱导:几乎所有的细胞资源都用于表达

5、目的蛋白,数小时后达细胞总蛋白的50%以上非诱导条件下:可使目的基因完全处于沉默状态而不转录结构基因：编码-半乳糖苷酶（Z）、透性酶（Y）和硫半乳糖苷乙酰转移酶（A）的基因。操纵子：包括启动子、操纵基因和结构基因调节基因、阻遏蛋白乳糖+阻遏蛋白，改变阻遏蛋白的形状。9.1.3乳糖操纵子9.1.4诱导原核表达的原理E.ColiBL21（DE3）：DE3是整合在细菌基因组上的一种携带T7RNA聚合酶基因和lacI基因的λ噬菌体，其基因型为：lacIlacUV5-T7gene1ind1sam7nin5lacI产生的阻遏蛋白与lac操纵基因结合，从而

6、不能进行外源基因的转录和表达，此时宿主菌正常生长。IPTG为乳糖的结构类似物，不能被细胞利用，特异结合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则外源基因大量转录并高效表达。9.1.5蛋白原核表达载体具备与克隆载体相同的条件：自主复制序列，可供筛选的遗传性状，MCS还必须具有用于外源基因表达的启动子、SD序列、及转录终止子等元件。pET系列：6HisTag（660Da-2kDa）pGEX系列：GST（26kDa）pMAL系列：MaltoseBindingProtein（52kDa）pET系列pGEX系列pMAL系列9.1.6融合蛋白融合蛋白:将两个

7、或多个开放阅读框按一定顺序连接,融合阅读框表达出一杂合蛋白融合标签:1.保护目的蛋白使之不被降解2.用于检测和纯化目的蛋白3.增加目的蛋白在细胞质中的可溶性4.帮助将目的蛋白运转到细胞周质中以提高其生物活性9.1.7阅读框架的保证pGEX系列DNA转录和RNA翻译，即遗传信息从基因流向RNA又流向蛋白质的过程总称为基因表达,基因表达可以在不同的水平上进行调控，如控制基因的开启、关闭和活性的大小，影响和控制转录和翻译等都属于基因表达的调控。影响转录水平的因素：强启动子，强终止子等。影响翻译水平的因素：SD序列，mRNA稳定性等。影响蛋白质水平的因

8、素：异源蛋白，易降解。9.1.8影响表达效率的主要因素9.1.9优化表达（1）增加蛋白质溶解性及折叠:温度:37C蛋白质以聚集的形式表达--包涵体3