一种新型的苯并呋喃并萘二酮衍生物8e在体内和体外对人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨培训课件.ppt

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1、一种新型的苯并呋喃并萘二酮衍生物8e在体内和体外对人类结肠癌细胞的抗增殖活性及其相关分子机理的探讨ppt结构1.Introduction2.Methodsandresults3.Discussions主要实验流程1.测定对比8e和阿霉素对癌细胞的增殖抑制效力（以半抑制浓度表示），并用倒置相差显微镜观察癌细胞前后形态2.用不同浓度的8e处理癌细胞24h和48h，并用流式细胞术分析癌细胞的细胞周期分布4.提取第2步得到的癌细胞中与细胞周期和信号转导相关的蛋白，并用Westernblot技术分析这些蛋白质的表

2、达水平，以推测8e的抑癌机理3.将癌细胞移植到无胸腺小鼠身上使其长成肿瘤，分析8e和阿霉素对肿瘤生长的抑制效果，并对肿瘤组织进行免疫组化分析1.Introduction背景：结肠癌是世界范围内的头号癌症杀手之一，每年有大约一百万的新增病例。尽管全球结肠癌的发病率在逐步下降，但近年来由于饮食习惯的西化，亚洲国家结肠癌患者数目显着上升。因此仍有必要开发新型的抗结肠癌药物。阿霉素(Doxorubicin)，一种蒽环类化合物，是临床上用来作为治疗癌症的药物。下面我们来看看8e和阿霉素(Doxorubicin)的

3、化学结构式。8e的结构式阿霉素(Doxorubicin)【作用与用途】阿霉素是一种广谱抗肿瘤抗生素，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，对多种肿瘤均有作用，属非周期特异性药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。但有一定的毒副作用。【毒性反应】白细胞和血小板减少，约60%~80%的病人可发生；100%的病人有不同程度的毛发脱落，停药后可以恢复生长；心脏毒性，表现为心律失常，ST-T改变(ST和T分别指两种心电波)、恶心、食欲减退；药物溢出血管外可引起组织溃疡及坏死。另外，用药后尿液可出

4、现红色。2.Methodsandresults2.1化学试剂（Chemicals）（略）2.2合成8e（Synthesisofcompound8e）：按已发表的文献提供的化学合成方法人工合成。2.3癌细胞的培养（Cellculture）：人结肠癌细胞HCL116由美国模式培养物保藏所（ATCC）提供，用加富的RPMI1640培养基培养，该培养基另外加入了10%热灭活的胎牛血清（FBS），100单位/mL青霉素（盘尼西林），100ug/mL链霉素，250ng/mL两性霉素B。置于含5%CO2的控湿氛围中培

5、养。2.48e和阿霉素对癌细胞抑制效力的测定：癌细胞HCL116(以1×104个/mL的密度植于96孔盘)分别加入不同浓度的8e或阿霉素(Doxorubicin)后置于37℃含5%CO2的控湿氛围中培养72h。经其他步骤处理后用570nm波长测量吸光度以求得存活细胞的数量，并用非线性回归分析的方法计算8e和阿霉素对癌细胞的半抑制浓度（IC50）。8e和阿霉素对癌细胞的半抑制浓度，结果计算结果表明阿霉素对癌细胞的半抑制浓度为46.2nm/L，而8e对癌细胞的半抑制浓度为52.9nm/L，8e的抑癌效力稍逊

6、于阿霉素。用8e处理癌细胞24h和48h后用倒置相差显微镜观察癌细胞的形态。虽然癌细胞存活的数量随8e浓度增大而递减，但实验组的癌细胞与对照组相比并没有明显的形态学变化。倒置相差显微镜对8e处理后癌细胞的观察结果8e处理后癌细胞变得稀疏，但没有明显的形态学变化。2.58e对癌细胞细胞周期分布的影响用磷酸盐缓冲液配制25、50、75nm/L的8e溶液为实验组，并以磷酸缓冲液为空白对照，分别处理癌细胞，在24h和48h后用流式细胞仪分析癌细胞的细胞周期分布。流式细胞术分析细胞周期分布的结果结果表明细胞周期停

7、滞在G0/G1时期与8e的浓度有关2.6蛋白质印迹分析将经过25、50、75nm/L的8e处理24和48小时后的癌细胞的总蛋白质提取出来后，用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）分离并电转移到聚偏二氟乙烯薄膜上，薄膜用特制的缓冲液在室温下处理1h，接着用以磷酸盐缓冲液稀释的特异性抗体进一步在4℃下过夜处理。然后用特制的缓冲液洗涤后，薄膜在室温下用二抗标记的辣根过氧化物酶继续处理2h，然后用荧光影像分析仪配合辣根过氧化物酶荧光检测试剂盒来显像。蛋白质免疫印迹分析图谱Ⅰ蛋白质免疫印迹分析图谱Ⅱ2.7小鼠体

8、内肿瘤生长抑制实验实验采用6星期大的雄性无胸腺小鼠(athymicmice)。在第0天将HCL116癌细胞悬液皮下注射到每只小鼠的右侧腹部，当肿瘤体积长到90—95mm3时（约在接种后第7天）开始用8e或阿霉素对小鼠进行治疗。实验之前小鼠被随机分为6组（5个实验组和1个对照组），每组6只。5个实验组：①阿霉素3mg/kg/day,②8e2mg/kg/day,③8e5mg/kg/day,④8e10mg/kg/day,⑤8e(5mg/kg/da