三碱性磷酸酶的分离纯化和Km测定演示教学.ppt

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1、三碱性磷酸酶的分离纯化和Km测定二、实验原理当温度、pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此时反应速度为最大速度（Vmax）。MichaelisMenten对酶促反应速度与作用物浓度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于1913年提出了数学方程式，即著名的米一曼方程式：作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为1/Km，根据在横轴上的截距，可以计算出该酶的Km。本实验以碱性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，

2、碱性磷酸酶能分解磷酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在碱性溶液中与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。其反应式如下：磷酸苯二钠磷酸盐+酚AKP酚+4-氨基安替比林红色醌类衍生物铁氰化钾PH10碱性利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性（A），按Lieweaver-Burk二氏法作图，从x轴上的截距求得其Km值。三、实验仪器及试剂仪器：恒温水浴锅，721型分光光度计。试剂：1.0.04mol/L作用物液：称取10.16g磷酸苯二钠（C6H5PO4Na2·2H

3、2O），用煮沸后冷却的蒸溜水溶解，并稀释至1,000ml，4ml氯仿防腐，加贮于棕色瓶内，置冰箱内保存，可用一周。2.0.1mol碳酸盐缓冲液（pH10.0）：称取无水碳酸钠6.36g及碳酸氢钠3.36g，溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.3.碱性磷酸酶液：用自己提取的碱性磷酸酶液，用pH10缓冲液稀释5-7倍。0.5mol/LNaOH溶液0.3%4-氨基安替比林：称取3g4氨基安替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏水溶解，并稀释至1,000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存。0.5%铁氰化钾：称取1

4、0g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，溶解后两液混合加水至2,000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存。四、操作步骤1、取大试管7支，按下表操作：加入酶液，混匀之后立即计时，各管在37℃水浴中准确保温15分钟后，立即加入0.5MolNaOH液1.0ml以终止反应。2、显色：各管中加入0.3%4氨基安替比林1.0ml和0.5%铁氰化钾2.0ml，充分混匀，放置10分钟，以0管为对照，在波长510nm下比色，记录各管的吸光度。3、作图：所测各管的吸光度代表各管中反应速度V，以之为纵轴，以作用物浓

5、度[S]为横轴，在坐标纸上连接各点作图，观察曲线的形状。以各管吸光度值的倒数为纵坐标，以作用物浓度的倒数为横坐标，作图并求此酶的Km值。五、实验结果（1）说说碱性磷酸酶提取过程中的注意事项（2）计算碱性磷酸酶的Km值单选题：1．下面关于酶的描述，哪一项不正确：AA、所有的酶都是蛋白质B、酶是生物催化剂C、酶具有专一性D、酶是在细胞内合成的，但也可以在细胞外发挥催化功能2．一个简单的米氏酶催化反应，当[S]<

6、S]浓度增加，Km值也随之变大3．酶的比活力是指：BA、任何纯酶的活力与其粗酶的活力比B、每毫克蛋白的酶活力单位数C、每毫升反应混合液的活力单位D、以某种酶的活力作为1来表示其他酶的相对活力是非题：1．如果有一个合适的酶存在，达到过渡态所需的活化能就减少。√2．T.Cech从自我剪切的RNA中发现了有催化活性的RNA,称之为核酶。√3．酶促反应中，酶饱和现象是普遍存在的。√此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢