常用的定量PCR荧光探针-生物化学与分子生物学教学文案.ppt

《常用的定量PCR荧光探针-生物化学与分子生物学教学文案.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、常用的定量PCR荧光探针-生物化学与分子生物学杂交法：序列已知，同时还要合成一个标记了的特异性探针。Dotblotting：不经过电泳，直接把检测样本点在一个适宜载体上，针对目标DNA分子或RNA分子进行杂交检测。Southernblotting：在电泳后，针对目标DNA分子的杂交检测。Northernblotting：在电泳后，针对目标RNA分子的杂交检测。目标DNA分子原位杂交检测。目标RNA分子原位杂交检测。核酸实验研究技术进展－12杂交法的优点与缺点：优点：Dotblotting：简单实用，适于进行大样本数同时检测。Northernblotting：如果检测结果

2、阳性，其可信度要远远高于RT-PCR，因此被誉为评价基因转录的GoldenMarker。Southernblotting：对DNA病毒类病原体等的检测实用性很强。缺点：Dotblotting：由于在同一斑点位置，除了目标核酸分子外，同时还存在其它的成千上万种不同的核酸分子，而这些核酸分子有可能会与探针分子部分结合，这会促进探针分子与目标核酸分子的结合，因此将可能导致阳性结果放大，甚至是假阳性结果。Northernblotting：对低拷贝mRNA有时检测不出来，容易导致假阴性结果。核酸实验研究技术进展－13例一：cDNAmicroarray检测SHEEC食管癌细胞NG

3、AL基因mRNA转录实验结果反向Dotblotting核酸实验研究技术进展－14例二：Northernblotting检测SHEEC食管癌细胞NGAL基因转录mRNA实验结果NGAL化学发光法核酸实验研究技术进展－15例三：Northernblotting检测缺氧复氧条件下心肌细胞EGR1基因转录mRNA实验结果EGR1同位素法核酸实验研究技术进展－16确保杂交法实验成功的八个关键点：关键点1：确保实验方案设计合理。关键点2：确保探针的特异性充分。关键点3：确保检测的灵敏度足够高。关键点4：确保样本质量合格。关键点5：确保实验试剂质量合格。关键点6：确保实验过程规范。关

4、键点7：对于编码序列的cDNA，要确保没有RNA的干扰。关键点8：几种杂交法，或杂交法与其它方法联合使用，相互印证，确保实验结果可靠。核酸实验研究技术进展－17PCR法：序列已知，同时还要合成一对特异性引物。核酸实验研究技术进展－1优点：实验的灵敏度很高，理论上可检测实验生物系统中所存在的1个拷贝目标核酸分子。阴性结果的可信度很高。缺点：由于容易存在样本污染情况，与此同时，毕竟在实验过程中存在着目标核酸分子拷贝数人为放大这样一个事实，因此，其阳性结果的可信度不如Northernboltting或Southernboltting。8例子：RT-PCR检测SHEEC食管癌细

5、胞NGAL基因转录mRNA实验结果NGAL600bpSMS:食管癌细胞SHEECM:DNAmarker核酸实验研究技术进展－19核酸实验研究技术进展－1确保PCR法实验成功的八个关键点：关键点1：确保实验方案设计合理。关键点2：确保引物的特异性充分。关键点3：确保样本质量合格。关键点4：确保实验试剂质量。关键点5：确保实验过程规范。关键点6：确保PCR变性、退火和延伸温度适度。关键点7：对于编码序列cDNA，要确保没有RNA的干扰。关键点8：几种PCR法，或PCR法与其它方法联合使用，相互印证，确保实验结果可靠。10核酸实验研究技术进展－1测序法：通过电泳等手段已知实验生

6、物系统中目标核酸的大致大小，而且是对照生物系统中不存在，或者两者相比在含量上可能有显著差别，然而序列未知。优点：可信度最高。对于解析鉴定未知核酸分子序列片段是必需的手段。缺点：目标片段边缘序列的测定结果有时不准确，在读原初测序图时要格外小心。11核酸实验研究技术进展－1目标片段边缘序列的测定结果有时不准确例子12PolyAtail核酸实验研究技术进展－113核酸实验研究技术进展－114核酸实验研究技术进展－1测定实验标本中目标核酸分子的含量15核酸实验研究技术进展－1通过Dotblotting，结合斑点光密度扫描分析，测定实验标本中目标mRNA分子、目标cDNA分子或目

7、标DNA分子的含量16A永生化食管上皮细胞SHEEB食管癌细胞SHEEC例子：cDNAmicroarray（反向Dotblotting）检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SHEE中NGAL基因转录mRNA相对含量实验结果判断标准：B/A2或0.5为显著性差异表达实际情况：B/A＝3.53核酸实验研究技术进展－117核酸实验研究技术进展－1通过RT-PCR，结合条带光密度扫描分析，测定实验标本中目标mRNA分子或目标cDNA分子的含量18例子：RT-PCR检测SHEEC食管癌细胞与永生化食管上皮细胞SH