常用分子生物学技术的原理及应用.ppt

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1、第二十二章常用分子生物学技术的原理及应用ThePopularTechnologyinMolecularBiology:PrincipleandApplication第一节分子杂交与印迹技术MolecularHybridization&BlottingTechnology核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。一、分子杂交与印迹技术的原理复性RN

2、ADNA（一）印迹技术（二）探针技术探针(probe)一小段用同位素、生物素或荧光染料标标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。二、印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹技术(Southernblotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。（二）RNA印迹技术(Northernblotting)用于RNA的定性定量分析。（三）蛋白质的印迹分析(Westernblotting)用于蛋白质定性定量及相互作用研究。其他斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点

3、阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip)三种印迹技术的比较③分子杂交实验①②目录放射自显影照片目录DNA点阵目录第二节聚合酶链反应PolymeraseChainReaction5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本工作原理目录Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+二、PCR体系基本组成成分三、P

4、CR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C（一）目的基因的克隆（二）基因的体外突变（三）DNA和RNA的微量分析（四）DNA序列测定（五）基因突变分析四、PCR的主要用途三、几种重要的PCR衍生技术（一）反转录PCR技术（二）原位PCR技术（三）实时PCR技术实时PCR技术原理目录第三节核酸序列分析NucleicAcidSequenceAnalysis核酸序列分析的基本原理化学裂解法(Maxam-Gillbert法)DNA链的末端合成终止法(sanger法)一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)基本原理基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2

5、个碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同的DNA片段，将这些片段经电泳分离。分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。二、DNA链末端合成终止法目录三、DNA自动测序采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA

6、碱基的排列顺序。DNA自动测序结果举例目录基因文库GeneLibrary第四节基因组DNA文库(genomicDNAlibrary)cDNA文库(cDNAlibrary)基因文库(genelibrary)是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体。目录第一轮筛选第二轮筛选第三轮筛选基因组文库筛选结果举例疾病相关基因的克隆与鉴定CloningandIdentificationofDiseaseRelativeGenes第五节克隆疾病相关基因的策略（一）功能性克隆(functionalcloning)（二）定位克隆(positionalcloning)（三）非定位候选基

7、因克隆策略(position-independentcandidategeneapproaches)（四）定位候选基因克隆策略(positionalcandidategeneapproaches)定义从对一种致病基因的功能的了解出发，克隆该致病基因。（一）功能性克隆应用生化机制已明确、基因表达产物较易得到部分纯化的遗传性疾病。克隆方式①利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；②根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探针，筛选cDNA文库。功能互补试验(functionalcomplementationassay)利用酵母系统从功