菌种鉴定流程教学提纲.ppt

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1、菌种鉴定流程2供试品的制备参看药典微生物限度检查法有抑菌活性的检品应进行预处理稀释法离心沉淀集菌法3000r/min离心30min，有不溶性沉渣先500r/min离心5min薄膜过滤法0.45um±0.02100ml中和法磺胺类100ml中1~5ml1%对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯80自然沉降法难溶于水的抗菌制剂同时做阳性和阴性对照了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下面的试验2005年4月16日星期六2中国药品生物制品鉴定所抗生素室3革兰染色、镜检3.1操作步骤3.1.1制片-过火固定，避免水冲，破坏细胞

2、结构使染料易透过3.1.2结晶紫染色-1分3.1.3碘液媒染-1分3.1.4乙醇脱色-30秒3.1.5沙黄复染-30秒2005年4月16日星期六3中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.2染色结果革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作质控株2005年4月16日星期六4中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.3革兰染色注意事项3.2.1玻片必须洁净3.2.2涂片菌量宜少，菌不可浓3.2.3新鲜培养物3.2.4脱色是关键2005年4月16日星期六5中国药品生物制品鉴定所抗生素室3.3革兰染色意义3.3.1初步识别细菌，利于进一步鉴定3.3.2初步选择治疗用

3、药物3.3.3与致病性相关，阳性以外毒素为主，阴性菌以内毒素为主2005年4月16日星期六6中国药品生物制品鉴定所抗生素室4触酶试验触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含有触酶可能导致假阳性出现用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否利于在有氧环境中生长细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢，具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生（链球菌，此试验可用于菌种鉴别）2005年4月16日星期六7中国药品生物制品鉴定所抗生素室2005年4月16日星期六8中国药品生物制品鉴定所抗生素室5氧化酶试验5.1试

4、验方法：滤纸，无菌玻璃棒，1滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液5.2结果判定：30s，培养物出现粉红色逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应2005年4月16日星期六9中国药品生物制品鉴定所抗生素室试验阳性图示2005年4月16日星期六10中国药品生物制品鉴定所抗生素室5.3氧化酶试验注意事项5.3.1试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠5.3.2试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒5.3.3试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用5.3.4反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以

5、免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反应5.3.5含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验，因为糖分解产酸抑制氧化酶活性2005年4月16日星期六11中国药品生物制品鉴定所抗生素室6血浆凝固酶试验简介主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶检测以试管法为参考方法2005年4月16日星期六12中国药品生物制品鉴定所抗生素室6凝固酶试验操作方法无菌试管(10×100mm)3支，加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液(1：1)各0.5ml，1支加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml，作为检品管；其余2支作对照管：1支加入金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］营

6、养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对照；另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照三管同时置36±1℃水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h2005年4月16日星期六13中国药品生物制品鉴定所抗生素室6凝固酶试验的注意事项血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维蛋白常已析出)易导致假阴性反应用试管法检查时，轻轻将试管倾斜，(动作勿大，防止江凝块摇碎)仔细观察试验时间过长容易导致假阴性2005年4月16日星期六14中国药品生物制品鉴定所抗生素室6凝固酶试验的结果判定阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管

7、液呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应；不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、准确性2005年4月16日星期六15中国药品生物制品鉴定所抗生素室7生化试验细菌鉴定的传统方法，参考方法因为针对不同菌种，选择有针对性的生化试验进行，菌种不同所作的试验不同，药品检验中常用的种类不再一一介绍，所以在以后各菌种鉴定内容当中单独讨论所有试验都需要已知阳性和阴性的菌株作为质控菌株，定期对试