植物组织中可溶性蛋白(MDA)的测定.doc

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时间:2020-12-21

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1、课程名称:植物生理学及实验实验类型:理论学习实验项目名称:植物组织中可溶性蛋白的测定1.实验目的和要求掌握植物组织可溶性蛋白的测定的理论和技术。2.实验内容和原理2.1.衰老是指细胞、器官或整个植株生理功能衰退,最终自然死亡的过程。2.2.衰老时的生理生化变化——蛋白质显著下降,核酸含量的变化、光合速率下降、呼吸速率下降、生物膜结构变化、植物内源激素的变化等。2.3.植物叶片衰老过程中,叶绿素含量下降,叶色变黄,蛋白质含量减少(可溶性蛋白)。2.4.自由基代谢失调,并在体内积累膜脂过氧化的产物之一:MDA3.主要仪器设备分光光度计、

2、离心管、移液枪等。4.操作方法与实验步骤4.1.制备蛋白提取液:称叶龄差异明显的叶片各0.50g,加入5ml磷酸缓冲液(50mmol,pH值为7.8),于冰浴中研磨提取,匀浆液以8000g离心力作用下(4℃)离心10min,其上清液即为蛋白提取液。4.2.样品的测定:取40ul蛋白提取液+160ul磷酸缓冲液于玻璃试管中,加入4.8ml考马斯亮蓝溶液,混匀后放置2min,用10mm厚的比色杯在595nm下比色读取OD值。对照为空白的磷酸缓冲液加上4.8ml考马斯亮蓝溶液。4.3.MDA的测定:1)取上清液1.0ml于7ml离心管中,

3、加TBA与TCA混合液4.0ml,然后在离心管盖上戳一小孔,92ºC水浴保温30min2)空白管:1mLPi-buffer+TBA与TCA混合液4.0ml(?92ºC水浴30min)冷却后,平衡,离心5min;10000rpm3)测定A532,A450和A6004.4.计算:1)可溶性蛋白含量(μg/g.FW)=标准曲线上查得的蛋白质量(μg)×提取液体积/(测定加样量×鲜重)2)MDA含量进一步求出单位鲜重植物组织中的MDA含量5.实验数据记录和处理5.1可溶性蛋白:老叶:3972.06(μg/g.FW);新叶:18328.48(

4、μg/g.FW)分析:说明在叶片衰老的过程中,可溶性蛋白的含量减少。5.2MDA:老叶:MDA(mM)=(0.383-0.023)÷155=0.(mM)=2.323(uM)MDA(uM)=6.45×(0.383-0.023)-0.56×0.792=1.8785(uM)新叶:MDA(mM)=(0.0825-0.0125)÷155=0.(mM)=0.4516(uM)MDA(uM)=6.45×(0.0825-0.0125)-0.56×0.2705=0.3000(uM)分析:MDA(mM)值均高于MDA(uM)值,说明蔗糖等物质确实对MBA

5、-TBA反应有干扰。故采用MDA(uM)值计算单位鲜重植物组织中的MDA含量。可得:老叶MDA含量=0.0939umol•g-1Fw;新叶MDA含量=0.015umol•g-1Fw分析:说明在叶片衰老的过程中,MDA的含量增加。6.讨论、心得6.1植物组织中还有一些物质对丙二醛测定(TBA法)干扰较大:  丙二醛(MDA)是由于植物官衰老或在逆境条件下受伤害,其组织或器官膜脂质发生过氧化反应而产生的,故而它的含量与植物衰老及逆境伤害有密切关系。测定植物体内丙二醛含量,通常利用TBA在酸性条件下加热与MDA反应,生成红棕色的三甲川,三

6、甲川的最大吸收波长在532nm。由于植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加,而且糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm处,在532nm处也有吸收,因此测定植物组织中MDA与TBA反应产物含量时一定要排除可溶性糖的干扰。此外在532nm波长处尚有非特异的背景吸收的影响也要加以排除。在532nm、600nm和450nm波长处测定吸光度值,即可计算出丙二醛含量。6.2植物组织中丙二醛的测定实验中,第二次离心的目的何在?因为此时已经加入了TBA溶液,并摇匀,且已经过沸水浴加热,上清液中已混有不少杂质,需再次离心才不会干扰

7、显色反应结果。6.3植物组织中丙二醛测定实验,研磨、离心时为何可以不用冰浴和低温?因为TBA与MDA的反应需要酸性和高温的条件,这样才能在532nm处有最大光吸收。

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