基因工程复习资料培训资料.doc

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1、__________________________________________________细菌的限制—修饰作用核酸限制性内切酶的类型及主要特性一个单位的限制性核酸内切酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50uL反应体系中，1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。同位酶：识别位点相同，但切点不同。同裂酶：识别位点和切点均相同，但来源不同。同尾酶：识别的

2、序列不同，但能切出相同的粘性末端____________________________________________________________________________________________________两种DNA连接酶（1）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。分子质量为68ku（2）T4噬菌体DNA连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平齐末端。分子质量为75kup35页表2-4简述DNA连接酶的作用机制及其特点___________________________

3、_________________________________________________________________________说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体，噬菌体载体，黏粒载体，噬菌粒载体，病毒载体，人工染色体等质粒的概念：质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA分子—眼虫、衣藻等）双链DNA分子（酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自身复制和表达。共价闭合环状DNA（SC构型）开环

4、DNA（oc构型）线形DNA（L构型）同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：　　　SCDNA最快、LDNA次之、OCDNA最慢。理想质粒载体的必备条件：A、具有较小的分子质量和较高的拷贝数B、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点）C、具有两种以上的选择标记基因D、缺失mob基因（载体的安全性：质粒不能随便转移、条件致死突变）E、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达（复制起点）、较小的宿主范围蓝白班筛选原理穿梭质粒载体(shuttlevector)：由人工构建

5、的具有两种不同复制子起点和选择性标记基因黏粒载体也称柯斯质粒载体：它是一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体噬菌体载体的优越性p69____________________________________________________________________________________________________黏粒载体的基本特点(P70)具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染等)；具有质粒载体的特性(易于克隆操作、选择及高拷贝等)；具有较高容量（35kb-45kb）的克隆能力；

6、具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。表达载体构建的一般原则1.阅读框架与外源基因高效表达2.启动子与外源基因高效表达3.转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达4.有效的翻译起始与外源基因高效表达5.终止密码子选择与外源基因高效表达6.外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达报告基因：用于检测与其组装在一起的嵌合基因在导入细胞后是否表达的一种指示基因探针：指经放射性或放射性物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列p115第八题PCR引物设计的一般原则：①引物长度一般在15~30碱基之间，Tm接近72℃较

7、佳。 ②碱基要随机分布，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。 ③G+C含量在45%~55%之间。 ④两个引物在3′端均必须与模板互补，5′端可以不互补。 ⑤引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹结构。 ⑥引物之间不能有连续4个碱基的互补，以免形成引物二聚体。 ⑦引物末位最好选A/G/C，不要选T，引物3′端要避开密码子的第3位。反转录PCR（RT-PCR)：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。快速扩增cDNA末端技术：PCR用于扩增代表mRNA转录

8、物某单一位点与其3’或5’末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术____________________________________________________________________________________________________基因文库：用分子克隆方法将某种生物或其组织的所有DNA片段插入适当的载体，转化适当宿主菌后，进行保存的克隆集合。p141cDNA文库的构建：以mRNA为模板，将体外反转录的cDNA、与适当的载体连接后转化受