液质联用在蛋白质分析中的应用.ppt

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1、高效液相色谱与质谱连用在蛋白质定量分析中的应用www.themegallery.comwww.themegallery.com蛋白质对生命的重要性蛋白质是组成人体重要的成分之一，是生命的物质基础。与营养、细胞结构、酶、激素、病毒、免疫、物质运转、遗传、生命的起源和进化都有着密不可分的关系。蛋白质对肝脏、肾脏、胶体浸透压、水肿等都起调节作用。蛋白质支持人体的神经和生理功能、大脑的兴奋与抑制，都离不开蛋白质的支持。一、蛋白质分析技术简介www.themegallery.com传统蛋白质定量分析方式凯氏

2、定氮及分光光度法染料结合法紫外可见吸光光度法荧光法蛋白质铍试剂体系的吸光光谱金属离子染料结合法蛋白质结构及改良的双缩脲反应蛋白质功效比值的测定一、蛋白质分析技术简介www.themegallery.comHPLC-ICPMS对蛋白质进行定量分析液相色谱与质谱连用技术，将有高分离能力及应用范围广泛的液相色谱法与具备高灵敏度和选择性并能提供物质分子量、元素组成及结构信息的质谱法结合起来，实现对复杂混合物更准确的定量和定性分析。而且也简化了样品的前处理过程，使样品分析更简便。一、蛋白质分析技术简介www

3、.themegallery.comHPLC-MS对蛋白质进行定量分析分析原理：保留时间对蛋白质进行定性分析蛋白质中特定元素在质谱中的信号强度对蛋白质进行定量分析硫元素存在于大部分蛋白质中，高分辨率质谱能够准确定量分析硫元素，将硫元素作为蛋白质中的代表元素进行定量分析，减少了化学反应步骤，分析简便快捷。一、蛋白质分析技术简介www.themegallery.com二、高效液相色谱及其在蛋白质分析中的应用简介www.themegallery.comHPLC分离原理高效液相色谱是溶质在固定相和流动相之间

4、进行的一种连续多次的交换过程，它借溶质在两相间分配系数、亲合力、吸附能力、离子交换或分子大小不同引起的排阻作用的差别使不同溶质进行分离。HPLC分析蛋白质不仅简便快捷，而且选择性好，分离效率高，检测灵敏度高。二、高效液相色谱及其在蛋白质分析中的应用简介www.themegallery.com高效液相色谱仪高效液相色谱仪:液体输送系统、进样系统、色谱柱检测系统二、高效液相色谱及其在蛋白质分析中的应用简介www.themegallery.com高效液相色谱分离蛋白质的优势①与结晶、过滤等传统分离方法比

5、较，它可以提供更佳的分离效果，并且一次可以得到2个以上的高纯度组分。②分析速度快，一般可在30min内完成。③样品回收简单，检出范围达ng或pg级。④方法灵活机动，只需更换色谱柱和检测器，便可适用于不同的分离要求。二、高效液相色谱及其在蛋白质分析中的应用简介www.themegallery.com蛋白质在物理、化学及功能上等特征上的差异为蛋白质的分离检测提供了基础。根据蛋白质的大小、形状、电荷、疏水性、功能等特性以及蛋白质的来源、实验室要求等可以选择不同的模式来分离目标蛋白质。蛋白质的分离依据二、

6、高效液相色谱及其在蛋白质分析中的应用简介www.themegallery.comHPLC分离蛋白质的几种模式反相高效液相色谱(RP-HPLC)高效离子交换色谱(HPIEC)高效凝胶过滤色谱，又称排阻色谱法（SEC）高效亲和色谱（HPAFC）高效疏水色谱（HIC）二、高效液相色谱及其在蛋白质分析中的应用简介www.themegallery.com三、高效液相色谱的技术要点——色谱柱和流动相www.themegallery.com三、高效液相色谱的技术要点—色谱柱和流动相色谱柱的关键内容是制备高效填料

7、。近年来的高效填料是使用了小颗粒（10μm、7μm、5μm、3μm）的无机氧化物，如硅胶，二氧化锆，三氧化二铝和有机多孔共聚微球作基质。在这些基质上键合各种化学基团或涂渍各种聚合物，形成各种具有选择性作用的高效固定相。硅胶为基质的色谱柱填料www.themegallery.comHPLC固定相举例以硅胶作为基质的反相色谱填料以其他氧化物作为基质的反相色谱填料，多以氧化铝、二氧化钛和二氧化锆为主无孔单分散填料有机高聚物填料、灌注色谱填料手性固定相填料三、高效液相色谱的技术要点——色谱柱和流动相www

8、.themegallery.comHPLC色谱柱的填充干法填充-适用于大颗粒湿法填充-适用于小粒径（流程图如右图所示）三、高效液相色谱的技术要点——色谱柱和流动相www.themegallery.com高效液相色谱的流动相HPLC对流动相的基本要求是：①与固定相不互溶，不发生化学反应。②溶剂对于待测样品，必须具有合适的极性和良好的选择性。③必须与检测器相适应。④流动相的粘度要小，可以降低色谱柱的阻力而提高柱效。⑤纯度高，不含机械杂质。三、高效液相色谱的技术要点——色谱柱和流动相ww