第六章--亲和分离技术.pptx

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1、第六章亲和分离技术生物大分子之间的特异性结合作用称为生物亲和作用（bioaffinity），简称亲和作用，如抗原与抗体、酶与酶原（或抑制剂、底物）、核酸与互补碱基链等。利用亲和作用纯化生物大分子的生化分离技术称为亲和分离技术，它是基于固定相的配基与生物分子间的特殊生物亲和能力的不同来进行相互分离的。第一节亲和技术发展1910年有人发现不溶性淀粉可以选择性吸附生物组织抽提液中的α-淀粉酶，这是亲和分离法的最初应用及报道。1951年Campbell等利用半抗原（对氨苯甲基）修饰纤维素制备的载体为亲和吸附介质从血清中纯化了抗体，这是人们开始有意识利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究。由

2、于亲和吸附介质制备技术的障碍，亲和分离技术的实用化进程进展缓慢。1967年Axen和Cuatrecasas等开发了利用溴化腈活化琼脂糖凝胶制备亲和吸附介质的方法，才使亲和分离技术从研究走向实用。20世纪80年代以后，亲和技术与其他分离技术如膜分离、萃取技术、电泳技术、色谱技术等相结合，相继出现了亲和色谱、膜亲和过滤、亲和萃取、亲和电泳等新型的亲和分离技术。其中最典型的是亲和色谱技术。第二节亲和分离原理一、生物亲和作用affinity（亲和）一词源于拉丁语的affinitus，原意为结婚或亲缘关系，因此在化学或生物化学中，affinity可以理解为分子之间的结合作用。实际上，亲

3、和作用不止限于生物物质之间，对于简单的化合物，如Na+和Cl-通过静电作用相互吸引的现象也是一种亲和作用。因此，亲和作用是自然界普遍存在的现象，只是生物分子间的亲和作用具有更高的选择性。生物物质，特别是酶和抗体等蛋白质，具有识别特定物质并与该物质的分子相结合的能力。这种识别并结合的能力具有排他性，即生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分子，选择性地与其中某一种分子相结合。生物亲和作用是生命诞生、维持与延续的重要基础，而亲和分离技术则是人类利用生物亲合作用的方式。亲和作用的本质：锁钥理论参与亲和作用的两个分子（或物质）中，其中之一为蛋白质的情况占绝大多数，或者两者均为蛋白质

4、。蛋白质是高分子化合物，种类繁多、结构复杂，其参与亲和作用的机理尚不完全清楚，一般认为是蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起状，能与该蛋白质发生亲和作用的分子恰好可以进入到此凹陷结构中，或者该蛋白质的凸起部位恰好能够进入与其发生亲和作用的分子的凹陷部位，就像钥匙和锁孔的关系一样。具有亲和作用的分子对之间具有钥匙和锁孔的关系是产生亲和作用的必要条件，但并不充分，除此之外，要想发生亲和作用还需要分子或原子水平的各种相互作用。（1）静电作用（2）氢键（3）疏水性相互作用（4）配位键（5）弱共价键静电作用：近距离产生较大的作用力，但应与其它因素结合才

5、能具有亲和识别作用。氢键：分子中的氧原子和氮原子，可形成氢键作用。与原子间距离有关，应较近。疏水性相互作用：需两分子都具有疏水性基团。配位键：咪唑基（组氨酸）和Zn2＋、Cu2＋、Ni2＋等产生配位键，形成金属螯合结构。弱共价键：可逆共价键，结合力较弱。二、影响亲和作用的因素1、离子强度离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互作用等。离子强度越大，静电力和氢键力都降低，而疏水作用增强。2、pH值在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其它pH下，亲和作用减弱或完全破坏。如：当蛋白质的结合部位存在羧基时，在pH值等于该羧基的pKa时，该羧基的50%带负电荷，当pH值高于pKa一个p

6、H单位时，该羧基的90%带负电荷，当pH值低于pKa一个pH单位时，该羧基的10%带负电荷。3、抑制氢键形成的物质脲和盐酸胍的存在可抑制氢键的形成，但容易使蛋白质变性。4、温度温度升高，静电力、氢键、金属配位键减弱，疏水力增强。5、离液离子SCN-，I-，ClO4-等离子半径较大的离液阴离子（破坏水化作用）存在时，疏水性亲和作用降低。6、螯合剂加入螯合剂（如EDTA），去除金属离子，破坏配位键，会使亲和作用消失。三、亲和作用体系将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物），使其从混合物中高选择性地分离纯化。一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的

7、配基（ligand），用L表示。Kd：解离常数Keq：结合常数Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～108L/mol，最高（生物素－抗生物蛋白）可达到1015L/mol。亲和配基必须具备的条件(选择原则)：（1）专一性识别或特异性作用必须是可逆的配基与被分离生物大分子之间的专一性识别或特异性作用，必须是可逆的。（2）结合常数要适当配基与被分离分子之间结合力要有足够高，以能形成稳定的复合物；同时结合又不能太强，否则洗脱困难。（3）稳定性好，可进行化学改性（4）固定到载体上后配基的专一性识别或特