猪圆环病毒研究概况.ppt

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1、猪圆环病毒研究概况芦银华陈溥言南京农业大学动物医学院1、猪圆环病毒(porcinecircovirus,PCV)概况2、PCV复合PCR方法的建立及初步应用3、PCV2毒株的分离及鉴定4、PCV2全基因组的克隆及序列分析5、PCV2分子克隆化病毒的构建6、PCV2主要结构蛋白基因(ORF2)的克隆与真核表达7、PCV2单克隆抗体的研制猪圆环病毒(porcinecircovirus,PCV)与鸡贫血病毒(CAV)、鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)和一些植物病毒同属于圆环病毒科(Circoviridae)成员,为单股负链环状DNA病毒,直径15-17nm,为已

2、知最小的动物病毒之一。PCV与同病毒科的CAV和PBFDV没有任何抗原交叉性及基因序列同源性。一、猪圆环病毒概况PCV基因组结构PCV-1、2基本情况1、PCV-1基因组全长1,759bp,PCV-2为1,768bp;基因组核苷酸序列同源性仅为68%-75%。2、PCV-1、2都主要包含ORF1、ORF2两个阅读框;ORF1编码与病毒复制相关的Rep蛋白;ORF2编码病毒的核衣壳蛋白,具有良好的免疫原性。3、PCV-1无致病性,广泛存在于猪源细胞及正常猪体内各组织中;PCV-2现证明与断奶仔猪多系统消耗综合征(PMWS)、猪皮炎肾病综合征(PDNS)及

3、A2型先天性综合征相关。PCV致病性及危害1、PCV可在猪源细胞培养物上繁殖,不产生CPE,易被忽视,因此对猪源细胞疫苗或诊断抗原生产造成潜在的危害。2、PCV-2多数情况下引起亚临床感染,但如与其他病原如PPV等混合感染或环境应激情况下则可直接发生PMWS。3、PCV-2的靶细胞为淋巴细胞,主要是B细胞,病毒感染后引起细胞凋亡,使机体免疫抵抗力下降,从而继发感染其他病原体,包括PRRSV、猪链球菌等,引起更严重的疾病。研究目的1、建立一套完整的便于实际推广应用的检测PCV感染的方法,如PCR、IFA及ELISA方法等。2、用建立的方法对我国主要养猪省

4、份进行PCV的流行病学调查,以便提出有效的综合防治措施;二、复合PCR方法的建立1、引物设计引物1(为PCV-1、2共同序列):5’-CCGCGGTGGCTGAACTT-3’(PCV-1nt478-496;PCV-2nt491-519);引物2(PCV-1特异序列):5’-CTCGGCTATGCGCTCCAAAATG-3’(PCV-1nt1108-1129);引物3(PCV-2特异序列):5’-ACCCCCGCCACCGTTACC-3’(PCV-2nt1627-1644)引物1、2扩增的片段长度为652bp,引物1、3之间的跨幅为1154bp。M123

5、MM:DNA分子量标准DL-20001:接种阳性PCV-1、2毒株的PK-15;2:接种阳性PCV-2毒株的PK-15;3:未接种病毒的PK-15。2000bp1000bp750bp500bp2、复合PCR方法的初步应用1)对多株猪源传代细胞(包括4株PK-15及1株ST细胞)进行了PCV检测,发现所有细胞均污染有PCV-1,其中一株还扩增出了PCV-2基因片段;M:DNA分子量标准DL-20001:PK-15(a)2:PK-15(b)3:PK-15(c)4:PK-15(d)5:ST12345M2000bp1000bp750bp500bp2)对38个病

6、例(病猪表现为消瘦、呼吸困难及淋巴结肿大等)的组织(取肺)进行PCR扩增。结果发现,9个病例同时存在PCV两种血清型病毒感染,23个病例感染有PCV-2。部分电泳结果见下图。12345678M91011121314M图中样品1、3、4、6、12、14扩增出了PCV-2核酸片段;8、9及11含有两种PCV的核酸;其余样品为阴性。三、PCV-2毒株的分离鉴定病料处理(将PCR扩增阳性的组织病料用氯仿抽提去除有曩膜的病毒,如PRRSV)接种细胞—PK-15盲传10代(300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理)间接免疫荧光实验及电镜观察病毒颗粒接种病料的PK-1

7、5的IIF结果未接种病料的PK-15的IIF结果超薄切片观察结果(30,000×)本实验室共分离鉴定了5株PCV-2,根据其分离地将其分别命名为ShanghaiPCV、JiangsuPCV、dengtaPCV、qingdaoPCV及xiaosanPCV。四、PCV2毒株全基因组克隆及序列分析1、DNAstar分析表明,PCV2全基因组1.768kb含有单一的EcoRI酶切位点。利用这一特点,上下游引物中都设计了EcoRI位点(-GAATTC-),以便于全基因组的体外操作。引物1:5’-GCGAATTCAACCTTAACCTTTCTTATTC-3’引物2

8、:5’-ATGAATTCTGGCCCTGCTCCC-3’2、PCR产物的克隆PCR电泳结果重组

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