最新中国人肥胖基因大肠杆菌中表达课件ppt.ppt

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1、中国人肥胖基因大肠杆菌中表达肥胖基因概述及发现肥胖基因(Obesegene)是近几年克隆的一个新基因,该基因产物———瘦蛋白(leptin)，是由脂肪组织产生并分泌167个氨基酸组成的多肽,分泌蛋白分子量约16kb,是反映体内脂肪组成及体内脂肪含量和调节体重的重要信号因子1783年Lavoisier和Laplace研究表明能量平衡受生理调节。1950年发现了第一个隐性基因突变，命名为肥胖基因(Obesegene），它是一个单基因突变，导致重度肥胖和2型糖尿病，但其研究一直进展甚微。动物试验表明将肥胖鼠和正常鼠

2、血液循环相连，肥胖鼠体重有所下降，提示正常鼠体内有一种因子可控制过度肥胖，而肥胖鼠则因基因突变而使该因子表达减少或作用丧失。经过8年努力，Friedman实验组运用定位克隆(Positionalcloning)技术，分离得到小鼠的肥胖基因并得到人的同源序列，为揭开肥胖症之迷及肥胖症的诊治奠定了基础。瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖系统，调节体内脂肪含量。实验表明，重组的瘦素具有使肥胖小鼠代谢和体重正常化，恢复肥胖基因缺陷小鼠生育能力等活性，而无明显的副作用〔4，5〕。脂肪组织：取自男性中国人胃切除手术病

3、人的正常大网膜，液氮冻存备用新鲜脂肪组织立即置于液氮冻存。取1克冻存的大网膜脂肪组织，剪成数小块，在总量为10ml的Trizol液中高速匀浆1分钟。将组织匀浆液吸入50ml离心管，于室温下静置5分钟，加入2ml氯仿，剧烈振摇混匀后，室温静置3分钟，然后11000g4℃离心15分钟，将上层无色水相吸入一新管，加入5ml异丙醇，室温孵育10分钟，然后11000g4℃离心10分钟，75%乙醇洗涤RNA沉淀，7500g4℃离心5分钟，稍干燥后用400μl无RNase的双蒸水溶解。（冷冻-离心-保存）RNA抽提肥胖基因

4、的原核表达用EcoRI和SalI将肥胖基因从pUC19载体上切下，克隆入六聚组氨酸融合表达载体pPROEXHTa质粒(图1)。pPROEXHTa重组质粒转化大肠杆菌（E.coli）DH5α菌株并经酶切电泳鉴定。接种重组质粒的单菌落于3mlLB中，37℃振摇培养过夜，按1%比例转接至30mlLB中，37℃振摇培养3小时，使OD600约等于0.3～0.4，加入IPTG至终浓度为0.4mol/L，继续培养3小时，离心收集菌体，进行SDS-PAGE电泳。示意图将肥胖基因克隆入pPROEXHTa六聚组氨酸融合表达载体，

5、获得表达的蛋白分子量为17.5Kd，表达量高达20%左右。用所得的瘦蛋白可以进一步研究瘦素作用机制及治疗肥胖症和糖尿病。最后结果特别说明在有些研究肥胖基因在大肠杆菌表达中，肥胖基因可在不同大肠杆菌、不同oD600值、不同时间诱导等条件下表达，从而可以研究外源基因在大肠杆菌中的表达量的效率。实验中我们曾分别用随机引物和P2引物来进行RNA反转录，结果后者的PCR得率要高得多。测序结果表明运用RT-PCR方法从中国人脂肪组织获得的肥胖基因序列与Friedman实验组报道的白种人完全一致，可见该基因在人种间可能没有

6、差异，属于高度保守序列，在功能上有极其重要的作用。对肥胖基因的原核表达，起初我们将肥胖基因克隆入pBL220原核表达载体，但未获得表达。后将其克隆入pPROEXHTa六聚组氨酸融合表达载体，结果获得了高效表达。运用该融合表达载体并可给产物纯化工作带来便利，只须用相应的亲和层析系统即可达到高质量的纯化。我们成功完成了中国人肥胖基因的克隆，并通过核苷酸顺序分析证明中国人肥胖基因和已报道的白种人DNA顺序完全一致。我们得到的基因可用作探针，用于研究肥胖基因在肥胖症和糖尿病等病人中的表达情况。通过将肥胖基因克隆入原核

7、表达载体，在大肠杆菌中表达，所得的重组瘦素可用于肥胖症和糖尿病的治疗研究，也可进一步探讨肥胖基因的作用机制。结果讨论谢谢欣赏！导演：黄富新主演：肥胖基因表达载体构建示意图1　PCR分子量标准　PCRmolecularweightmarker2　RT-PCR扩增产物　RT-PCRproduct箭头所指为肥胖基因条带　Arrowindicatestheobesegeneband运用Trizol试剂得到了非常满意的总RNA，电泳条带显示18s和28srRNA分别在1.7kb和4.5kb位置，比例约为1:2，可见总R

8、NA完整性和片段大小均很好。根据已知序列设计引物，以中国人脂肪组织RNA为模板，结果非常特异地扩增出约500bp片段的肥胖基因条带(下图)。肥胖基因的分子克隆及酶切鉴定1　DNA分子量标准　DNAmolecularweightmarker2　重组的pUC19质粒　RecombinantpUC19plasmid3　重组的pUC19质粒经EcoRI和BamHI酶切　　RecombinantpUC19pl