最新遗传性疾病的分子诊断PPT课件.ppt

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1、遗传性疾病的分子诊断用分子生物学技术通过检测基因而达到诊断疾病的目的是生物学者在分子生物学技术发展的最初阶段就有的设想。1976年人们开始在实验室进行研究，1984年以来，基因检测在许多国家已成为常规项目，主要用于遗传性疾病的诊断。一、遗传性疾病的分类常染色体连锁遗传性疾病——致病基因位于常染色体性染色体连锁遗传性疾病——致病基因位于性染色体二、遗传性疾病中常见的分子异常遗传性疾病的产生是由于一个（或数个）基因发生异常导致这些基因所载有的遗传信息受到改变，而发病是通过遗传物质的表达产物——蛋白质（或酶）的表现异常

2、所致。基因突变主要包括三大类，即点突变、片段性突变和动态性突变。（一）点突变点突变：DNA分子中单个碱基的替换终止密码子突变：点突变导致提前产生终止密码，或终止密码突变而编码一个氨基酸使肽链延长。错义突变、无义突变、移码突变各种点突变所造成的后果：蛋白质分子量改变、蛋白质合成量下降、无蛋白质合成。（二）片段性突变核苷酸的丢失和增多缺失：基因中硷基（遗传物质）的丢失插入：外来基因片段插入某一基因序列中倍增：基因内部某一段序列发生重复基因重排：基因组中原来不在一起的基因由于某些原因组合排列在一起。（三）动态性突变以三

3、核苷酸为单位的重复序列，在传递过程中不稳定，会发生扩展，即子代的重复次数往往较亲代大为增加，因此又称动态性突变。脆性X综合征：CGG重复少年脊髓型共济失调：GAA重复……三、遗传性疾病基因诊断的策略（一）直接诊断策略基因诊断的直接策略就是通过各种分子生物学技术检测基因的遗传缺陷，因此直接诊断的前提是被检测基因的正常序列和结构必须被阐明。直接诊断由于是直接揭示遗传缺陷，因而比较可靠。（二）间接诊断策略间接诊断的实质是在家系中进行连锁分析，通过分析可确定个体来自双亲的同源染色体中的哪一条为致病染色体，从而判断该个体是

4、否带有致病基因。间接诊断不是寻找DNA的遗传缺陷，而是通过分析DNA的遗传标记的多态性估计被检者患病的可能性。四、基因诊断所采用的技术(一)直接诊断所采用的技术DNA片段性突变的检测（1）Southern印迹技术将基因组DNA用限制性酶水解成无数片段经凝胶电泳后用碱处理使凝胶中的DNA变性为单链，转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上，用标记探针与变性单链杂交，可使特异条带显影。（2）多重PCR技术在一个PCR反应体系中放入多对引物，当基因的外显子发生缺失时，根据条带缺失的数目和引物相应的位置，可判断基因中哪一个或哪几个扩

5、增部位发生缺失。2.点突变（1）已知点突变的检测方法a）PCR-RFLP利用正常序列或突变序列是否处于限制性内切酶的酶切位点而设计。若点突变处于某一限制性内切酶的酶切位点内，可在突变点两侧设计引物，使PCR产物含有该突变序列。用相应的内切酶对正常产物和突变产物进行水解并作电泳分离，可根据水解片段的大小和电泳位置区分二者。b）等位基因特异性寡核苷酸杂交被检基因经PCR扩增后转移到膜上，分别与长度为15~20bp、经标记的正常序列和突变序列的寡核苷酸探针杂交。由于20个碱基中仅一个碱基差异即可使DNA分子的Tm值下降

6、5~7.5℃，因此通过严格控制杂交条件，可使PCR产物仅与完全互补的探针杂交，根据有无杂交信号即可判断被检者的扩增片段中是否带有突变点。C）PCR-ELISA将PCR产物用ELISA方法加以检测的技术。在对目的基因扩增时，dNTP中同时混有用生物素标记的Bio-16-dUTP，使扩增产物带有生物素标记。若该产物能与突变点特异的寡核苷酸探针（3’端地高辛11-DIG-ddUTP标记）杂交，则该产物便带有地高辛标记信号，可利用与抗地高辛抗体共价结合的酶标检测系统进行显色反应，从而判断突变的存在。d）寡核苷酸连接检测（

7、oligonucleotideligationassay，OLA）——设计2个探针（探针A和B），探针A、B分别位于被检片段的5’和3’端，探针A的3’端与探针B的5’端紧邻，A探针的5’端和B探针的3’端分别用生物素和地高辛标记。设计引物时使突变位点位于A探针的3’末端处。被检标本经PCR反应后，使产物变性，同时与两个探针杂交，根据ELISA显色反应检测有无连接产物的形成即可知PCR产物中是否含有突变点。e）DNA芯片技术（DNAchip）在固相支持物(硅片、玻璃、聚丙烯或尼龙膜等）表面有序地阵列一系列固定于一

8、定位置的分子（探针），当标记样品（如用化学荧光法、化学发光法标记）与探针进行杂交后，用共聚焦荧光自动扫描等技术获取信息，经计算机系统处理、分析后得到结果。目前主要有2种类型：基片上就位合成寡核苷酸点阵芯片(ONA）和微量点样技术制作cDNA点阵芯片（CDA）。（2）未知点突变的检测方法a)单链构象多态性（single-strandconformationalpolymor