最新酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生(ppt x页ppt课件.ppt

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1、酶学与酶工程第五章酶分子修饰学生(PPTX页)通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变,从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。包括物理修饰、化学修饰,分子改造等一、酶修饰的作用1.稳定酶的天然构象与增强耐热性2.保护酶活性部位与抗抑制剂3.维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4.降低酶的抗原性及稳定酶的微环境5.改变酶学性质第一节概述选择修饰剂时要考虑几点:①修饰剂的相对分子质量、修饰剂链的长度对蛋白质的吸附性;②修饰剂上反应基团的数目及位置;③修饰剂上反应基团的活化方法与条件。2.选择反应条件①反应体系中酶与修饰剂的分子比例;②反应体系的溶剂性质、盐

2、浓度和pH条件;③反应温度及时间。3.修饰剂的活化活化基团才能在一定条件下与酶分子的某侧链基团进行反应4.修饰将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液,以一定的比例混合,在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间,使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合,对酶分子进行修饰。5.分离需要通过不同的方法进行分离,将具有不同修饰度的酶分子分开,从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。二、金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子,使酶的特性和功能发生改变的修饰方法成为金属离子置换修饰。金属离子置换修饰的方法:酶的纯化、去除原有的金属离子、加入置换离

3、子金属离子置换修饰的作用:十一次课三、酶分子侧链基团修饰功能基团主要有氨基、羧基、巯基.咪唑基、吲哚基、酚羟基、羟基、胍基、甲硫基酶侧链基团的修饰方法很多,主要有氨基修饰、羧基修饰、巯基修饰、酚基修饰、胍基修饰、咪唑基修饰、吲哚基修饰及分子内交联修饰等各种氨基酸侧链的修饰剂氨基酸侧链基团修饰剂Lys氨基三硝基苯磺酸,2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu羧基水溶性碳化二亚胺Arg胍基苯乙二醛,1,2-环己二酮、丁二酮Cys巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTTHis咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr酚羟基碘、四硝

4、基甲烷Trp吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺四、大分子结合修饰利用水溶性大分子与酶结合,使酶的空间结构发生某些精细的改变,从而改变酶的特性与功能的方法称为大分子结合修饰法,简称为大分子结合法。大分子结合修饰是目前应用最广的酶分子修饰方法,通常使用的水溶性大分子修饰剂有:右旋糖酐,PEG、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等。使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物,如聚乙二醇、右旋糖苷等,它们既能通过氢键固定在酶分子表面,也能通过氢键有效地与外部水相连,从而保护酶的活力。一些添加物,如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。另一类添

5、加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时,其表面区域内排除了水分子,因而增加了相互作用力,其稳定性也就增加了。非共价修饰用可溶性大分子,如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等,通过共价键连接于酶分子的表面,形成一层覆盖层。例如:用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶,不仅可以降低或消除酶的抗原性,而且提高了抗蛋白酶的能力,延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合,可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍;每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合,酶活力达到原有酶活力的5.1倍共价修饰大分子修饰(共价)的过程修饰剂的选择:大分子结合修饰采用的修饰

6、剂是水溶性大分子。例如,聚乙二醇(PEG)、右旋糖酐、蔗糖聚合物(Ficoll)、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。(均相反应,无毒害)修饰剂的活化:作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化,然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。修饰:将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液,以一定的比例混合,在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间,使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合,对酶分子进行修饰。分离:需要通过凝胶层析等

7、方法进行分离,将具有不同修饰度的酶分子分开,从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性,在体内无毒性、无残留、无免疫原性,并可消除酶的抗原性,使其末端活化后可以与酶产生交联,因而,它被广泛用于酶的修饰。酶半衰期相对稳定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350五、肽链有限水解修饰利用酶分子主链的切断和连接,使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变,从而改变酶的特性和功能的方法。酶蛋白主链修饰主要是靠酶切/酶

8、原激活法。

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