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1、噬菌体展示载体的构建中国药科大学JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2002,33(6):529,532529噬菌体展示载体的构建吴国球,沈子龙.(中国药科大学生物技术中心,南京210009)摘要目的构建适宜噬菌体展示的载体系统•方法利用pCOMB的LacZ强启动子,Pelb引导序列，包膜蛋白？基因，用NHe—XbaI双酶切，切除一个克隆位点；同时设计一对引物，用PET—28(a)作模板扩增550bp片段,插入Xhol—SpcI位点之间,扩增质粒后用限制性内切酶，PCR,DNA测序等方法作
2、鉴定.结果切除了272bpNHe—XbaI片段,插入片段后酶切鉴定显示：Xhol,Spcl单酶切,XbaI,NheI无酶切；所构质粒用Xhol+Spcl双酶切及PCRT增均可见550bp片段;测序结果正确.结论成功构建了一种高拷贝,稳定,多用途,易于操作的噬菌体展示载体.关键词噬菌体展示;构建;载体中图分类号：Q78文献标识码:A文章编号:1000—5048(2002)06—0529—04噬菌体展示文库在新药开发领域,尤其在全人源化单克隆抗体方面为扩展生物多样性提供了强大的研究工具[】].它能容纳超过上百万个单个分子的克隆,因此
3、又称全套基因库,可以通过受体与配体,抗原与抗体相结合的特性,从中筛选出目的基因克隆,使目的基因能在很短的时间内（数周）高效克隆,筛选和表达[2].文库的大小是决定生物多样性的关键.因此构建一种高拷贝,稳定,多用途,易于操作的载体具有十分重要的意义.l材料和方法1.1材料pCOMB质粒,XL1—blue菌株（东南大学基础医学院张建琼博士惠赠）,PET—28（a）质粒JM109菌株（本实验室保存）,限制性内切酶Nhel,Xbal,Sacl,Spel,Xhol（Mm）,T4连接酶，琼脂糖,EDTA,DNA回收试剂盒等（上海生工）,LB
4、,SOC按常规方法配制,PCR仪（AmpGene4800）电泳仪（北京六一仪器厂）.引物:P1:5'-GGGCCAACTCTAGTATGGCCC下划线为Xhol酶切位点P2:5'-GG垒！垒!CTAACCAGCAC'ITCAGTGG一AA下划线为Spcl酶切位点Ck连宝生物工程公司合成）1.2方法收稿日期2002—04—17通讯作者Tel:025—32713891.2.1pCOMB3的扩增含pCOMB的XL1—blue接种于四环素（50mg/L）,氨苄青（100mg/L）双抗平板,37?过夜培养，挑单个菌落，接种l0ml的LB液
5、体增菌培养液，37~C6h,摇至ODeoc为0.36,按常规方法抽提质粒:按每毫升菌液l00ll液（50mmol/LGlucose,25retool/LTris—HC1,l0retool/LEDTA）,200l?液（0.24mmol/LNaOHI00l,5SDSl001）,l50l?液（3mmol/LK.Ac,2.5mmol/LHAc）混匀,12000r/min5min,吸取上清液,等体积酚:氯仿抽提一次,上清液加两倍体积的无水乙醇,4?放置10min,12000r/min离心5min,弃上清,沉淀挥干后，加无菌水201,—20
6、.C保存备用.1.2.2片段切除及剩余片段的连接pCOMBslOI,加10xbuffer4l,去离子水34l,Nhel,Xbal各1.01,37?酶切2h,回收片段,201水溶.取5I力卩IOxligationll,去离子水3.5l,T4连接酶0.5l,16?连接过夜.1.2.3感受态细胞制备及转化XL1一blue单菌落接种于100mlLB(含氨苄青100mg/L),37?摇至OD600为0.4,8000r/min2min收集菌液，按每毫升菌液加0.5mol/LCaCl2lOOgd,冰上放置30min,8000r/min20mi
7、n,弃上清，沉淀用相同浓度CaC1z悬浮菌液,lOOp1分装，加l0甘油，—70?保存.取连接液5l,加入lOOpI感受态细胞，冰上放置30min,42?530中国药科大学33卷热激90s,加入预热SOCIml,37?摇45min,涂布于四环素(50mg/L),氨苄青(100mg/L)双抗平板，同时设阴，阳性对照,37?过夜，随机挑选单菌落扩大培养，抽提质粒,分别用Nhel,Xbal,Sacl,Spel,酶切检查,0.8琼脂糖l00v/50mA电泳40rain,EB染色,观察结果.阳性质粒命名为Pa.1.2.4插入片段的制备1.
8、2.4.1插入片段的扩增PET—28(a)质粒抽提后，取II力卩l0xbuffer3l,P13~1(50pmo1),P23~1(50pmo1),Taq酶0.5I,dNTPII,力卩D2o至30I,加一滴矿物油,94?变性5min后执行94?变性lmin,45?退
