最新22 生物化学实验--纸层析法测定肝组织的转氨基作用.doc

《最新22 生物化学实验--纸层析法测定肝组织的转氨基作用.doc》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、精品资料22生物化学实验--纸层析法测定肝组织的转氨基作用........................................精品资料纸层析法测定肝组织的转氨基作用【目的】1．掌握纸层析法的原理和方法。2．熟悉相关转氨酶的临床意义。【原理】转氨基作用是氨基酸代谢的一个重要反应。在转氨酶作用下，将氨基酸的氨基转移到α-酮酸上。每种转氨基反应均由专一的转氨酶催化。转氨酶广泛分布于机体各器官、组织，例如肝细胞中存在的丙氨酸氨基转移酶，能催化α-酮戊二酸与丙氨酸之间的转氨基作用。反应式如下：纸层析是以滤纸作

2、为支持物，与滤纸纤维素结合的水（约占纸重20～30％）称为层析中的“固定相”。另一种和固定相不能混合或部分混合的溶剂则为“流动相”。把欲分离的物质加在纸的一端，并使流动相借滤纸的毛细现象移动，此时，待分离溶质因分配系数不同而逐渐分布于滤纸的不同部位。层析过程中或层析结束时，用显色剂使被分离的物质显出颜色，成为一个个色斑。分配在固定相中趋势较大的成分在纸上随流动相移行的速度就小，色斑距原点的位置就较近。反之，分配在固定相内趋势较小的成分移行就远，色斑位置离原点也远。溶质在纸上的移动速率可用比移（Rf）表示：同一氨

3、基酸在相同的层析条件下Rf值相同，不同氨基酸在相同层析条件下Rf值不同，因此可以根据Rf........................................精品资料值来鉴定被分离的氨基酸。层析时，用显色剂茚三酮使氨基酸显色，将样品氨基酸的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，即可确定所分离氨基酸的种类。【器材】1．研钵2．剪刀3．恒温水浴4．点样毛细管5．漏斗6．表面皿或小平皿7．新鲜动物肝脏8．直径10cm圆型新华滤纸9．中试管和小试管10．电炉或吹风机或烘箱11．直径10cm的培养皿【试剂】1．0.2

4、mol/L，pH7.4磷酸缓种液Na2HPO4溶液81ml与0.2mol/LNaH2PO4溶液19ml混匀，再用蒸馏水稀释20倍。2．0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.891g先溶于少量pH7.4磷酸盐缓冲液中，以0.1mol/LNaOH仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。3．0.1mol/L谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735g，先溶于少量pH7.4磷酸缓冲液中，以1mol/LNaOH仔细调节至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至50ml。4．0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液............

5、............................精品资料称取α-酮戊二酸1.46g先溶于少量pH7.4磷酸缓冲液中，以1mol/LNaOH仔细调至pH7.4后，用磷酸缓冲液加至100ml。5．层析剂（展开剂）取100ml重蒸苯酚与25ml水摇匀，加入茚三酮使终浓度达0.1%。【操作】1．酶液制备取新鲜的动物肝脏1g，放入研钵中用剪刀剪碎，取9ml冰冷pH7.4磷酸缓冲液，先加2ml，迅速研磨成匀浆，再加入7ml。2．保温（酶促反应）取干燥中试管2支，分别标明测定与对照，各加入肝匀浆0.5ml。测定管放入

6、37℃水浴保温10min，对照管放入沸水浴中煮10min，冷却后于两管中分别加入0.1mol/L丙氨酸溶液0.5ml，0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5ml，pH7.4磷酸缓冲液1.5ml，摇匀，放37℃水浴保温1h，保温完毕，立即将测定管放入沸水浴中煮10min以终止反应，取出冷却后，将测定管和对照管分别过滤，收集滤液于小试管中备用，并分别标明测定与对照。3．层析与显色取直径为10cm的圆型新华滤纸一张，用圆规作半径为0.5cm的同心圆，通过圆心作三条夹角分别为60℃的直线（图3-10），与同心圆相交叉为6个

7、交点，按顺时针标记各点。在1、4两点分别点0.1mol/L丙氨酸溶液和0.1mol/L谷氨酸溶液2次。方法是用毛细点样管在滤纸上点样，注意斑点不要太大（一般直径约0.3cm），而且每点1次待晾干后再点第2次。照此方法，在2、5处各点测定管过滤液3次，在3、6两处各点对照管过滤液3次。　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　图3-10层析点样示意图........................................精品资料在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔芯大小），另取同类滤纸约1cm2,下一半剪成须状，

8、卷成圆筒如灯芯，插入小孔，稍突出滤纸面即可。将层析剂放入直径为3～5cm的干燥表面皿或小平皿中，表面皿或小平皿管置于直径为10cm的培养皿中，将要层析的滤纸平放在培养皿上，滤纸芯浸入溶剂中，而后在其上再盖一培养皿以封闭（图3-11），这时可见层析溶剂沿滤纸芯上升到滤纸，再向四周扩散，约45min后，等溶剂前缘距滤纸边缘1cm时即可取出，用电炉烤干或吹风机吹干或在60℃烘箱中烘干，此时可