western blotting protocol

《western blotting protocol》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、WesternBlot原理WesternBlot（WB）是通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WesternBlot流程图聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）转膜封闭洗膜（3×5mins）孵育一抗（4度过夜或室温4-6小时）洗膜（3×10mins）孵育二抗（室温2小时）洗膜（3×10mins）显影SDS-PAGE分离蛋白的原理和操作一.形成和结构聚丙烯酰胺凝胶电泳是由单体丙烯酰胺和交联试剂N-N’-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和增速剂的情况下聚合而成。丙烯酰胺的单体形成长链，由N-N’-甲叉双丙烯酰胺的功能基团和链末端的功

2、能基团反应而交联。通常丙烯酰胺的聚合有两种.81.化学聚合常用过硫酸铵，过硫酸钾来引发这个过程，用TEMED，三乙醇胺作为加速剂，这种引发-增速的催化系统是氧化-还愿过程。当TEMED溶液中加入过硫酸铵后，过硫酸铵产生自由基，而丙烯酰胺和自由基作用活化，活化的烯酰胺形成多聚长链。2.光聚合光聚合的催化剂是核黄素，在紫外线作用下，核黄素生成含自由基的产物，丙烯酰胺和自由基作用活化，活化的烯酰胺形成多聚长链。我们实验室采用的是化学聚合的方法。二.作用原理聚丙烯酰胺凝胶电泳是网状结构，具有分子筛效应，它有两种形式，一种是非变性聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质在电泳中保持完整的状态，蛋白在其中依三种因素分开.蛋

3、白大小，形状和电荷。而SDS-PAGE仅根据蛋白分子量亚基的不同而分离蛋白。这个技术首先是1967年由shapiro建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小，电荷因素可以忽视。SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。而强还原剂如巯基乙醇，二硫苏糖醇(DTT)能使绊胱氨酸残基间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入还原剂和SDS后，分子被解聚成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的蛋白量，这样就消除了

4、不同分子间的电荷差异和结构差异。SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。1.浓缩胶浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。当样品液和浓缩胶选TRIS/HCL缓冲液，电级液选TRIS/甘氨酸。电泳开始后，HCL解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低电导区，而电场强度与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅

5、速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。2.分离胶8分离胶孔径较小，通过选择合适的凝胶浓度，可以使样品很好的分离。当样品进入分离胶，PH，凝胶孔径改变，使慢离子的涌动率变大，超过蛋白，高强度电场消失。因此蛋白在均一的PH，和电场强度下通过分离胶。如果蛋白分子量不同，通过分离胶受到的摩擦力不同，涌动率也不同，因此能够根据蛋白的分子量不同而分开。三.常用参数聚丙烯酰胺的特性，包括机械性能，弹性，透明度，孔径大小取决于T，C，T是两个单体(单体丙烯酰胺和N-N’-甲叉双丙烯酰胺)的总百分浓度，C是与总浓度有关的交联百分比浓度。T=(a+b)/mC=b/(a+b)（a为单体

6、丙烯酰胺的克数，b为N-N’-甲叉双丙烯酰胺的克数，m为缓冲液终体积）a，b的比例很关键，如果a.b小于10，胶脆，硬。如果a.b大于100，胶糊状。一般有弹性，透明的胶，a.b比例应在30。一般的胶联度是随着T的增加而降低的，在5%-20%交联度的公式C=6.5-0.3T而T是根据分离物质的分子量大小决定，因为蛋白在不同浓度凝胶的迁移率，是随总浓度的增加而降低的。因此在分离不同分子量的混合物时，要选适宜浓度的凝胶。一般SDS-PAGE的有效分离范围如下表.表1SDS-PAGE的线性分离范围丙烯酰胺浓度（％）线性分离范围（kD）1512~431016~687.536~945.057~212四.

7、常见问题及解决办法.1.纹理和拖尾现象.由于样品溶解不佳引起的，克服的方法可以在加样前离心，增加一些增溶辅助试剂如尿素。2.蛋白带过宽，与邻近泳道的蛋白带相连是由于加样量太多，可以减少上样量。3.电泳时间比正常要长。可能由于凝胶缓冲系统和电级缓冲系统地PH选择错误，即缓冲系统地PH和被分离物质的等电点差别太小，或缓冲系统的离子强度太高。84.指示剂成微笑符号（指示剂前沿呈现向上的曲线形），说明凝胶