人参βas基因之表达调控及功能分析

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1、人参βAS基因之表达调控及功能分析第1章绪论1.1选题的目的意义人参的药用价值在世界范围内被广泛关注，其药用价值的深入研究和活性成分的鉴定正在大量开展[3]；但由于受资源限制，植物病害严重，如红肤病和根腐病等，导致人参栽培种植越来越困难，又因为人参栽培时间长(从播种开始6～7年达成熟期)，直接从人参中获取人参皂苷的成本日趋增高[4]，传统的田间种植模式已经很难满足日益增长的人参市场需求；近年来，科学家通过生物技术手段来改良、培育新品种并快速大量繁殖人参种苗或利用基因工程技术建立转基因组织、器官或植株，以满足人参皂苷

2、生产需要，取得了一定成果[5-6]，但仍有一些明显不足，如皂苷生产效率较低等，因此利用代谢工程来使人参皂苷得到过量生产，进而提高人参皂苷生产效率，是一个很有前景的策略[7]。到目前为止，人参皂苷的合成途径尚未完全明确，在人参体内2,3-氧化角鲨烯流向三条代谢途径，一条是合成固醇类物质，另外两条是合成皂苷类物质（达玛烷型皂苷、齐墩果烷型皂苷），达玛烯二醇合成酶（dammarenediol-Ⅱsynthase，DS）和β-香树素合成酶（Beta-amyrinsynthase，βAS）分别是是控制2,

3、3-氧化角鲨烯进入两条不同皂苷合成途径的关键酶[8]；由于齐墩果烷型皂苷中只有Ro一种，而且是药理活性很小，含量也非常小，属于次要皂苷，因此，通常认为人参的主要活性成分为达玛烯二醇合成酶催化合成的达玛烷型三萜皂苷。本研究采用RNAi技术，通过干扰人参发根中βAS基因的表达，明确β-香树素合成酶（βAS）在人参皂苷合成中的功能作用，为进一步揭示人参皂苷具体的合成机制奠定基础；另一方面，通过干扰βAS基因，抑制药理活性较小的齐敦果烷型人参皂苷的合成，而使代谢流向主要活性成分达玛烷

4、型人参皂苷合成途径，从而达到增加人参皂苷含量的目的，实现人参种质创新；因此本研究具有广泛的理论和现实意义。............1.2人参皂苷研究现状人参皂苷是人参次级代谢产物，属三萜皂苷；目前，研究表明人参总皂苷是由100多种人参单体皂苷组成的，根据薄层板上斑点的Rf值从底部到顶部的顺序，人参单体皂苷被命名为RX(X=0，A-1，A-2，B-1，B-2，B-3，C，D，E，F，G-1，G-2，H-1，，X)[9]；同时，由于人参皂苷是糖的衍生物，主要是由糖的半缩醛羟基与非糖结合而成化合物，非糖部分称为苷元，因此

5、，根据苷元结构的不同，人参皂苷被分为两大类，即达玛烷型和齐墩果烷型[10]，其中绝大部分的单体皂苷为达玛烷型，其基本骨架是四环；根据碳-3、-6和-20上糖基的位置的不同，以及其上边可以是空的或与糖环相连情况的不同，达玛烷型人参皂苷又可以被进一步分为原人参二醇型（包括Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg3、Rh2等）和原人参三醇型（包括Re、Rg1、Rg2、Rh1等）两类；而齐墩果烷型人参皂苷只有一种人参皂苷Ro，其苷元是齐墩果酸，基本骨架为五环。从人参中已被分离出来的单体皂苷达40多种，包括最近从除人参根以外

6、的其他部位，如人参花蕾、加工人参、人参叶片中分离出的新型人参单体皂苷，其大部分属于达玛烷型；其中被研究和关注最多的人参单体皂苷有Rb1、Rb2、Rc、Rd、Rg1、Rg2、Rg3、Re、Rf、Rh1和Rh2等[11]；而新发现的人参单体皂苷的生物活性仍有待进一步的研究。第2章βAS基因RNAi元件的设计与构建2.1引言人参皂苷合成关键酶RNAi研究的第一步就是RNAi元件的引物设计，人参中β-香树素合成酶基因有PNY1和PNY2，构建其RNAi元件需要对这一对基因的序列进行比对，确定β

7、-香树素合成酶基因编码序列的保守区域；同时，βAS与DS，LS，CAS等其他三个关键酶基因的序列也是有一定的相似性的，为了增强βAS基因RNAi的特异性，同时避免其对其他关键酶基因的影响，还需要在保守区域的基础上再与DS，LS，CAS关键酶基因进行序列比对，以确定RNAi元件所作用的区域[61]；因此，本研究干扰元件引物的设计是通过两次的序列比对，综合酶切位点的设计，在生物信息软件的帮助下确定其引物序列，利用重组PCR技术构建得到人参βAS基因的RNAi元件，为下一步构建工程菌以及人参

8、发根的遗传转化奠定基础。.............2.2材料与方法2.2.1材料MS固体培养基培养3周的人参发根，本实验室保存；试剂：RNA提取试剂盒，DNA胶回收试剂盒，RT-PCR相关试剂购自宝生物工程(大连)有限公司，PfuDNA聚合酶购自生工生物工程(上海)股份有限公司。以配制1000ml液体培养基为例，其余配制量根据需要同比例增加或减少。取1000