一株产胶原蛋白酶芽孢杆菌的分离及鉴定

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1、一株产胶原蛋白酶芽孢杆菌的分离及鉴定生物科学2003级李军指导老师吴琦副教授摘要：从皮革厂、畜肉市场、屠宰场等处采样，分离得到49株明胶水解活性的细菌。经活性平板初筛、牛皮消化实验和活性测定，筛选得到一株胶原蛋白酶活性为35.97U/mL的菌株。经形态学观察、生理生化特性和16SrDNA序列分析，鉴定该菌株为短小芽孢杆菌。关键词：胶原蛋白酶，短小芽孢杆菌，分离，鉴定IsolationandIdentificationofaBacilluspumiluswithCollagenaseActivityLIJunBiologicalSc

2、ience,Grade2003DirectedbyWUQi(AssociateProf.)Abstract：Forty-ninebacterialstrainswithglutinhydrolyzationactivitywereisolatedfromleatherhouse,marketandslaughterhouse.Byscreeningmedia,freshcalfskindecompositionandactivitydetection,onestrainwasscreenedwithcollagenaseactiv

3、ityabout35.97U/mL.Furthermore,seenfrommorphology,physiologybiochemistrycharacteristicand16SrDNAsequencing,itwasidentifiedasaBacilluspumilus.Keywords：Collagenase，Bacilluspumilus，Isolation，Identification胶原蛋白或称胶原是由动物细胞合成的一种生物性高分子。广泛存在于动物骨、脚、软骨和皮肤及其它结缔组织中，约占哺乳动物总蛋白的1/3。多数

4、类型的胶原蛋白分子都由3条肽链组成，3链相互缠绕，形成了胶原蛋白分子特有的杆状结构[1]。胶原蛋白是一类重要的资源，在许多方面都有重要的作用。在饲料工业中：胶原蛋白作为一种高效的动物性蛋白营养添加剂[2]。在生物医学材料方面的应用：制作心脏瓣膜；血管修复的替换血管装置；作为烧伤伤口的敷料（使血液凝固，具有止血功能）；制造人造皮肤[3]。15在食品方面：胶原蛋白材料制备薄膜材料；制造肠衣等可食用包装材料；作为肉制品添加剂、保健食品等[3]。另外，胶原蛋白具有优良的吸湿、保湿性能以及抗皮肤衰老功效,一些知名品牌公司已推出了纯胶原蛋白和

5、一系列添加了纯胶原蛋白的护肤品[4]。胶原蛋白得到了广泛的应用，大量的需求突出了提取胶原蛋白迫切性，用胶原蛋白酶进行生产就是其中重要的一种方法。胶原蛋白酶是指作用于胶原或其变性明胶而不作用其它蛋白质的酶类，它来源广泛，多种微生物以及动物的许多组织细胞都可以产生胶原酶。胶原酶在环境保护上可用于皮革边角废弃物变废为宝，高值转化；在医学研究中可用于治疗腰椎间盘突出症、瘢痕疙瘩、杜普伊特伦症等，具有极大的应用价值。来自溶组织梭菌（Clostridiumhistolyticum)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)等的胶原蛋

6、白酶已有广泛的研究。目前，已从许多动物组织和微生物中获得胶原蛋白酶[5]。本研究从屠宰场筛选到一株胶原蛋白酶产生菌，并鉴定为短小芽孢杆菌，现报道如下。1材料方法1.1实验材料1.1.1样品来源分别从雅安市杨皮匠皮革厂、肉市场、农村宰猪厂等处采集土样、水样。1.1.2试剂Ⅲ型胶原蛋白（SIGMA公司）；柱式细菌DNAout提取试剂盒（绵阳高新区天泽基因工程有限公司）；牛皮：川农兽医院周皓师兄提供的初生小牛的牛皮；水合茚三酮；抗坏血酸；乙酸；乙酸钠；Tris试剂；无水乙醇；三氯乙酸；HgCl2；盐酸；乙二醇甲醚；牛肉膏；蛋白胨；明胶；

7、K2HPO4·3H2O；NaH2PO4·2H2O；NaCl；KH2PO4；MgSO4·7H2O；葡萄糖等。试剂均为分析纯试剂。1.1.3器材实验过程中所使用的仪器有：PCR仪；电泳仪；TGL-16G离心机，MS2旋涡混和器，Haier冰箱，DNP-9272型电热恒温培养箱，HZQ-F全温振荡培养箱，洁净工作台，BS210S电子天平，CX210FS1生物显微镜，YX280A手提式不锈钢蒸汽消毒器，DK-98-1型电热恒温水浴锅，微量加样器，DHG-9246A15型电热恒温鼓风干燥箱，WXZ-UV-2102紫外可见分光光度计，酸度计，

8、以及离心管，EP管，培养皿，接种环（针）等。1.1.4培养基[5]种子培养基(1000mL):牛肉膏5g,NaCl5g,蛋白胨10g,pH7.2～7.4富集培养基(1000mL):明胶1g,NaCl5g,蛋白胨5g,pH7.2～7.5初筛培养基(1