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1、HBV靶向性HDV核酶载体的筛选实用癌症杂志2005年11月第20卷第6期ThePracticalJournalofCancer,November2005.Vol2O.No.6?561?HBV靶向性HDV核酶载体的筛选栾中华韩金祥鲁艳芹王传玺裴晓俊?基础研究?【摘要】目的探讨利用核酶(ribozyme)独特的切割抑制活性,抑制乙型肝炎病毒的复制生长,可以用来治疗乙型病毒性肝炎.利用各种方法筛选出HBV靶向性HDV核酶载体.方法根据山东省医药生物技术研究中心构建的HDV核酶结构特点,筛选并合成核酶序列,构建到原核载体中,转染到细胞中,根据测定
2、载体的抑制效果,从而筛选出效果好的核酶载体.结果通过ELISA检测和定量PCR检测筛选出了2种抑制效率高的HDV核酶,抑制率达68%.结论应用ELISA检测和定量RT—PCR检测联合的方法可以筛选出比较符合细胞内条件的核酶,以便后续实验.【关键词】核酶;丁型肝炎病毒;乙型肝炎病毒;基因治疗中图分类号:R512文献标识码:A文章编号:1001—5930{2005)06—0561—03TileScreeningofHBVTargetingHepatitisDeltaVirusRibozymeVectorsLUANZhong—hua,HlANJi
3、n—xiang,LL,Yan—qin,eta1.ShandongMedicinalBiotechnologyCentre,Jinan,250062【Abstract】0bjectiveToapproachtheuniquecleavageingandinhibitingcharacteroftheRibozymetoinhibitthegrowthandreplicationofHBVcanbeusedtocureHBVhepatitis.TosecreenthebetterHBVtargetingHDVribozymewiththemul
4、titudemethods.MethodsAccordingtothecharacterofHDVribozymethatconstructedbyShandongMedicinalBiotechnologyCentre,screenandcomposetheribozymesequence,buildintotheprokaryotatevector,andtransferintothecell,mensuratetherestraineffecttoscreenthebestrlbozymevector.ResultsWegaintwo
5、highinhibitingribozyme,theinhibitionrateis68%.ConclusionWecanuseELISAandRealtimeRT—PCRtOscreentheribozymesuitabletothecellcondition,thatcanbeusedfortheexperimentinthefu—ture.【Keywords】Ribozyme;HepatitisDvirus(HDV);HepatitisBvirus(HBV);Genetherapy(_r『lePracticalJournal0厂Can
6、cer,2005,2O:561--563)核酶(Rz)是具有酶性质的RNA分子,可序列特异性地结合并切割RNA,通过人工设计核酶即可达到破坏目的基因表达的作用…1.随着人们对核酶生化生物学特性的进一步了解,核酶作为1种成熟的,可剪切的特异性RNA,且长期使用对细胞无副作用的分子生物学方法,越来越受到重视.HDV核酶是惟一在人体细胞天然具有裂解活性的核酶类型,它的活性发生在丁型肝炎病毒基因组复制的中间环节【2I.HDV的复制依赖于HBV编码的蛋白质,所以在其生活史中它一直伴随着HBV的存在,因此,研究将HDV核酶作为HBV的反义抑制剂可能有着
7、其独特的优势.本研究旨在探讨不同位点的靶位对于核酶的抑制效果的影响,筛选出抑制效果好的核酶载体.1材料与方法资助项目:国家自然科学基金(编号30371328)作者单位:250062卫生部生物技术药物重点实验室山东省医药生物技术研究中心1.1试剂与材料脂质体为invitrogen公司产品,DMEM高糖培养基为Gibco公司产品,T4DNA连接酶为Promega公司产品,各种限制性内切酶购自TAKARA公司.HBsAg,HBeAg酶联检测盒为荣盛公司产品.酶标仪为VMAX公司产品,核酶序列合成Invitrogen公司完成,质粒提取试剂盒为QIA
8、GEN公司产品,HepG2215细胞为本实验室保存.1.2方法1.2.1核酶载体的筛选与构建通过比对全基因组的HBV序列,找到其保守区域,并且参照文献【3J3确定了靶向性作用的位
