酶联免疫吸附试验-elisa

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1、实验四酶联免疫吸附试验(ELISA)免疫标记技术定义:将抗原-抗体反应与标记技术相结合,用放射性同位素、酶或荧光素标记的已知抗体或抗原,通过检测标记物,间接测定未知的抗原或抗体。分类:放射免疫测定法:131I,32P免疫荧光技术:FITC,PE免疫酶测定法:HRP,AP免疫酶测定法(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酶(AP)特点:高度特异性:保持抗原抗体反应的特异性高灵敏度:酶催化底物显色的高效性,pg水平微量检测定性定量检测:反应液颜色深浅或光密度值分类:酶联免疫吸附试验:可溶性抗原或抗体酶免疫组化法:组织

2、中或细胞表面的抗原。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶标记抗原或抗体检测液体(血液、细胞液)中未知抗体或抗原的方法。1.定义2.原理(1)利用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接(或建立关联)。(2)通过酶与底物产生颜色反应,用于定量测定。它将酶促反应的高效率和免疫反应的高度专一性有机地结合起来,可对生物体内各种微量有机物的含量进行测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。3.分类直接法(directELISA):将已知抗原直接吸附于载体,加酶标抗体检测抗体间接法(IndirectELISA):将已知抗原吸附于固相载体,加酶标记二抗

3、检测液相中未知抗体双抗体夹心法(SandwichELISA):将已知抗体吸附于固相载体,酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法(CompetitiveELISA):将已知抗体或抗原吸附于固相载体,酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体(1) 直接法测定抗原A.将抗原吸附在载体表面;B.加酶标抗体,形成抗原—抗体复合物;C.加底物。底物的降解量=抗原量。(2)间接法测定抗体A.将抗原吸附于固相载体表面;B.加抗体,形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗体;D.加底物。测定底物的降解量=抗体量。(3)双抗体夹心法测定抗原A.将抗体吸附于固相表面;B.加待检抗原,形成抗原-抗体复合物;C.加酶标抗

4、体;E.加底物。底物的降解量=抗原量。(4)竞争法测定抗原A.将抗体吸附在固相载体表面;B.加入酶标抗原和待测抗原,竞争结合抗体;对照只加入酶标抗原;C.加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差=未知抗原量。酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)4.原理(以间接ELISA为例):显色间接法测定猪瘟抗体——定性检测实验材料猪瘟病毒(CSFV)——抗原样品——待测猪血清HRP标记猪抗兔IgG——二抗包被缓冲液:0.025MpH9.6碳酸盐缓冲液洗涤液:含0.05%Tween20的0.01MpH7.4PBS底物缓冲液:pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底

5、物溶液:TMB,底物缓冲液,30%H2O2酶标板,酶标仪间接法测定猪瘟抗体——定性检测实验方法1.抗原的处理:2.包被抗原:取酶标板,加入100μL/孔的抗原稀释液4℃,湿盒内,18h取出包被好抗原的酶标板(4孔/组),甩干孔内液体以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min/次3.加待测血清标记各孔,加入相应液体100μL/孔1234阴性空白阳性待测4.加二抗:37℃,湿盒内,30min甩干孔内液体以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min/次各孔加入酶标二抗100μL/孔37℃,湿盒内,30min5.显色:甩干孔内液体以洗涤液(200μL/孔)洗涤3次,3min/次加入底物溶液100μL

6、/孔避光显色,10min6.观察结果实验方法1、取已包被猪瘟病毒抗原的酶标板(根据样品多少,可拆开分次使用),用样品稀释液(PBS)将待检样品1∶40稀释后加入板孔中,每孔加100μl。同样1∶40稀释阴、阳性对照血清,阴、阳性对照各设1孔,每孔100μl。另设一空白对照孔,空白对照孔加100μl稀释液。轻轻振匀孔中样品(勿溢出),置37℃温育30分钟。2、洗板:甩掉板孔中的溶液,用洗涤液洗板3次,200μl/孔,每次在干净吸水纸上拍干。3、每孔加酶标二抗(抗猪IgG-HRP结合物)100μl,置37℃温育30分钟。4、洗板:洗涤3次(方法同步骤2)。5、显色与终止:每孔加底物A液、B液各1滴

7、(50μl),混匀。室温避光显色,10分钟后,每孔加终止液(0.25%氢氟酸)1滴(50μl),终止反应。6、15分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值≥0.35为阳性。具体操作步骤预期结果阳性:显色为黄色(蓝色)阴性:无色1234阴性阴性阳性阳性注意事项洗涤彻底,避免交叉污染。按顺序加样,孔底无气泡。包被和温育在湿盒内进行。

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