5 葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质

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1、葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质教学目标了解：层析技术的基本原理;有效分配系数Kav的计算。理解：葡聚糖凝胶的选择和准备。掌握：凝胶层析的原理和操作方法;有效分配系数Kav的意义。重点：凝胶层析的原理和实验步骤。分配系数与被分离分子量之间的关系。难点：掌握装柱,加样,洗脱,收集样品的操作步骤。蛋白质的分离纯化蛋白质分离纯化的方法很多，主要是根据蛋白分子之间特异性的差异，如分子大小，溶解度，电荷等建立起来的。性质方法分子大小透析、超滤、密度梯度离心、凝胶层析等溶解度等电点沉淀、盐析、有机溶剂沉淀等电荷电泳、离

2、子交换层析等吸附性质吸附层析对配体分子的亲和力亲和层析凝胶层析（又叫分子筛层析或排阻层析）指混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离的技术。凝胶层析的基本原理凝胶：一些具有立体网状结构和一定孔径的高分子化合物。分子大于凝胶孔隙范围的物质：随着溶剂在凝胶颗粒间流动分子小于凝胶孔隙范围的物质：渗入凝胶颗粒的孔隙中凝胶层析的过程凝胶层析过程的数理关系凝胶干体积Vg外水体积Vo内水体积Vi柱床体积Vt=1/4D2h=Vg+Vo+Vi洗脱体积（Ve）：自加入样品时算起，到组分最大

3、浓度出现时所流出的洗脱液体积。凝胶层析的分配系数分配系数Kav：表示任何一种被分离的化合物被凝胶排阻的程度。Kav与凝胶柱的总体积Vt、外水体积Vo、洗脱体积Ve有关：Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化思考：为什么分离物分子量越大Kav值越小Kav=（Ve—Vo）/（Vt—Vo）？葡聚糖凝胶柱层析法的特点天然凝胶：一些糖类物质，如淀粉、琼脂及琼脂糖等。人工合成凝胶：葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两大类。葡聚糖凝胶（Sephadex）：由许多右旋葡萄糖单位通过1，6-糖苷键联结成链状结构，再由交联剂交

4、联形成不溶水的多孔网状高分子化合物。型号：G200、G150、G100、G75、G50、G25、G15型号（G-X）分离范围（分子量Da）适用范围G10~G25<700~5,000脱盐、小肽等G-501,500~30,000低分子量蛋白、多肽G-753,000~70,000中、低分子量蛋白、多肽G1004,000~150,000中、高分子量蛋白G150~G2005,000~800,000高分子量蛋白Sephadex的常见规格（分级范围）X：①交联度。X越小，交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子量产品。反之

5、亦然。②吸水量。G-25表示：1g干胶吸水2.5mL，依次类推。本实验中用SephadexG50（分离分子量范围1500~20000），以蒸馏水为洗脱剂。待分离的蛋白质混合物：蛋白A（黄色，分子量在G50的分离范围内）蛋白B（蓝色，分子量大于G50的分离范围）实验步骤凝胶的准备装柱加样与洗脱样品收集1.凝胶的准备：称取SephadexG501g，置于锥形瓶中，加蒸馏水约30ml，在沸水浴中煮沸1h，冷却到室温后再装柱。充分溶胀后的凝胶以倾斜法除去表面悬浮的小颗粒，反复2~3次。层析柱洗净后，将层析柱烧结板下

6、端的死区用蒸馏水充满（注意：不得留有气泡，可多加约1cm高水层，使柱内凝胶通过沉积作用更加均匀），然后关闭层析柱的出口。将已溶胀的凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌入柱中，待底部凝胶沉积1～2cm时，再打开出口，继续加入凝胶悬液至凝胶沉积约10cm高即可（注意：凝胶悬液尽量一次加完，以免出现不均匀或分层的凝胶带）。反复加蒸馏水，平衡10min。2.装柱（2～3人一组）3.加样与洗脱加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出，待凝胶床面只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出口（注意：不可使凝胶柱表面干涸，可预留约0.2cm

7、高水层）。用移液枪将200µl样品小心加到凝胶柱表面（注意：加样时垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加，动作要轻柔）。然后打开出口，使样品进入床面，滴加1~2倍样品体积的蒸馏水（注意：轻柔滴加）。待样品完全流入床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱。4.样品收集：样品一旦加入后马上用烧杯收集流出液，注意柱床上要不断加水，直到两种蛋白全部洗脱。倒出凝胶，清洗层析管。5.结果分析：分析为什么这两种蛋白能在凝胶柱中分离开。注意事项装柱时需保持柱体垂直于水平面，在平衡完毕前不可随意晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。实验过程中需

8、密切注意保持层析柱中的凝胶始终处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。移液器使用：选择适当量程正确安装枪头吸液第一档，放液第二档垂直吸液，慢吸慢放吸液后不可将枪平放使用完后调至最大量程小结凝胶层析的原理：混合物随流动相经过装有凝胶作为固定相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离。凝胶层析分配系数：被分离的化合物被凝胶排阻的程度。Kav=（Ve—Vo）/（Vt—Vo）葡聚糖凝胶柱层析：葡聚糖凝胶为多孔网状高分子化合物及交联