实时荧光定量pcr技术与应用

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1、实时荧光定量PCR技术与应用北京元业伯乐科技发展有限公司提纲PCR简介荧光定量PCR技术原理荧光化学物质简介多重PCR与内参照基因定量方法定量PCR技术延伸基因分型（SNP）检测熔解曲线分析实时荧光定量PCR技术简介：PCR概念什么是PCR？PolymeraseChainReaction(PCR)聚合酶链反应是在体外选择性的扩增特定DNA片段的方法。PCR循环第一步加热变性、双链打开第二步退火、引物与单链结合第三步-引物延伸变为两个双链DNA常规PCR常规PCR技术：理论上PCR产物的积累是按照

2、2n指数扩增PCR后借助电泳对扩增反应的终产物进行定量及定性分析DNAEngineS1S2M常规PCR常规PCR结合电泳分析方法的局限性只能对终产物进行分析，无法对起始模板准确定量对终产物分析，受PCR过程平台效应的干扰，定量准确度难以提高（相对误差＞1000%）存在扩增产物的污染问题。必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，费时费事而且EB有毒无法对扩增反应实时检测提纲PCR简介荧光定量PCR技术原理荧光化学物质简介多重PCR与内参照基因定量方法定量PCR技术延伸基因分型（SNP）检测熔解曲线分

3、析实时荧光定量PCR技术简介：定量PCR定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析IQ5Real-timePCR仪定量PCR实时荧光定量PCR三个关键词：实时，荧光，定量如何实时检测？？？借助荧光物质示踪扩增产物量的变化PCR反应混合物Mg2+Mn2+dCTPdGTPdTTPdATPTaqDNA多聚酶引物模板DNA或缓冲液荧光物质荧光曲线随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个

4、循环，收集一次荧光强度信号，得到一条荧光扩增曲线图定量原理如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析引入两个概念：荧光阈值、Ct值定量原理荧光阈值在荧光扩增曲线指数增长期设定一个荧光强度标准(即PCR扩增产物量的标准)阈值线Ct值的概念定量原理Ct值的定义是PCR扩增过程中，扩增产物(荧光信号）到达阈值时所经过的扩增循环次数C(t)值C(t)值18.12+/0.04-阈值线浓度低浓度高模板起始浓度越高，Ct值越小定量原理CT值与模板起始浓度的关系哪个样品浓度高？为什么要用C

5、t值定量实时荧光定量PCR方法利用Ct的概念，在指数扩增的开始阶段进行检测，此时样品间的细小误差尚未放大，因此该Ct值具有极好的重复性。Ct值的重现性终点处检测产物量不恒定；Ct值则极具重现性Ct值的重现性相同模板在同一台PCR仪上相同条件下重复96次扩增的扩增曲线图阈值选择阈值的选择荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在指数扩增阶段任意位置上缺省设置一般是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。但实际应用时要结合扩增效率、线形回归系数等参数来综合考虑定量原理理想的PCR反

6、应：X=X0*2n非理想的PCR反应：X=X0(1+Ex)nn：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率在扩增产物达到阈值线时:XCt=X0(1+Ex)Ct=N(1)XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量.在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为N.方程式(1)两边同时取对数得:logN=logX0(1+Ex)Ct(2)整理方程式(2)得:logX0=-log(1+Ex)*Ct+logN(3)Ct=-1/log(1+Ex)*logX0+logN/log(1

7、+Ex)(4)Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模板量定量原理初始模板的对数值与循环数（CT值)呈线性关系初始模板量越多,扩增产物达到某一值（域值）时所需要的循环数越少确定初始模板的浓度定量原理Absolute（绝对定量）DeterminesinputquantityofanucleicacidtargetRequiresastandardcurveRelative（相对定量）Determinesfolddifferencesininputtarge

8、tnucleicacidquantitiesbetweensamplesPerformedwithorwithoutastandardcurveTypicallyusedforgeneexpressionanalysiswithatargetgenenormalizedtoareferencegene14500copies定量方法定量原理：利用已知起始拷贝数的标准样品作出标准曲线,通过未知样品的Ct值,从标准曲线上计算出该样品的起始浓度。绝对定量荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T