talen技术原理及应用

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1、TALE序列组装方法（一）TALEN技术的发展一、TALEN技术?TALEdomain:DNA识别域?▲TALE,植物病原体黄单胞菌Xantomonas–用于调控宿主基因?▲由34的氨基酸长度的重复单位构成?▲第12,13位点氨基酸（repeat-variabledi-residue，RVD）不同?▲RVD决定识别位点不同?Nucleasedomain:DNA剪切域?▲FokI,发现于海床黄杆菌Flavobacteriumokeanokoites?▲TypeIIs限制性内切酶?▲采取其非特异性DNA结合域?▲形成二聚体时发生剪切（二）TALEN结构（三）TALEN基本原理TALE靶点识别模块

2、构建；一对重组核酸酶在靶点识别结构域的作用下，识别靶点核酸序列；FokI结构域形成二聚体,发挥非特异性内切酶活性,剪切DNA,形成DSB（Double-StrandBreaks)；诱发DNA损伤修复机制。NatBiotechnol2013Jan;31(1):23-4Talen介导的同源重组,取代传统的基因打靶技术张博教授北京大学生命科学学院细胞增殖与分化教育部重点实验室NatureMethodsApr;10(4):329-31（2013）同源重组&knockinNatureBiotechnology29，731-734（2011）无基因序列、细胞、物种限制。整个实验简单准确、实验周期短、成本

3、低。毒性低、脱靶情况少。成功率可达90%以上。TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。靶序列识别模块不受上下游影响，特异识别并打断基因组中的任意靶序列。成对的TAL识别模块保证了基因敲除靶点的准确性。已经成功应用到了植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象。（四）TALEN特点（五）TALEN广泛应用BiotechnolBioeng.2013Mar18.doi:10.1002/bit.24890二、TANLEN技术基本流程靶点设计TALEN连接细菌转化DNA质粒抽提酶切鉴定质粒测序挑单克隆细菌培养测序正确质粒体外转录生成mRNA细胞水平检测TALEN活性受精卵注射mRN

4、AChimera小鼠F1杂合子小鼠F2代纯合子小鼠Step1Step2Step4Step3Step5Step7Step6Step8Step9Step10①输入基因名点击search确定打靶的基因以及靶位点三、TALEN打靶载体设计策略②搜索结果中选择物种,如Musmusculus③点击打开该基因序列选择GeneBank④在例表中寻找CDS区⑤下载TBX2sequence.fastahttps://tale-nt.cac.cornell.edu/中设计左右臂靶点序列TBX2sequence.fastaTALEN的设计原则如下：1、左、右臂的长度一般为12-19bp2、左、右臂之间的spacer

5、一般长度14-21bp3、第零位为TFastTALETMTALEN快速构建试剂盒四、TALEN质粒制备FastTALETMTALEN的特点?简单:一步连接无需PCR和胶回收?快速:一天完成TALEN质粒构建三天得到测序正确质粒?高效:有效性≥90%?经济:每条TALEN质粒低于500元根据上述设计好的TALEN识别序列，选择模块加样左臂：5`-GAGAGAGCCGGCGCTG-3`首个标记为1,最后一个标记为9,依次类推进行标记。例如：5’-GAGAGAGCCGGCGCTG-3’，将最后一个碱基去掉，其余碱基标记为GA1、GA2、GA3、GC4、C5、G6、G7、CG8、CT9；也可标记为：

6、GA1、G2、AG3、A4、GC5、C6、GG7、CG8、CT9;或其余标记方式。右臂：5`-GGAACGGGTGGTAAGC-3`标记为GG1、AA2、CG3、GG4、T5、G6、G7、TA8、AC9；详细查看“TALEN试剂盒使用说明书”为了避免污染，所有加样过程应在超净台进行。由于模块数量较多，为了避免出现错误。建议加样时两个人操作溶液3必须完全溶解才能用（可放入37°C水浴溶解）获得TALEN质粒平板，挑取单克隆（Kana+）过夜培养的菌液取4-5ml进行质粒小抽双酶切鉴定（BamHI、PstI）测序鉴定（双向测序、引物是试剂盒中提供的305、306）左、右臂标准序列与测序结果在NC

7、BIBLAST中比对（氨基酸blast）TALEN质粒鉴定左臂序列比对（L3）获得最终测序正确的TALEN质粒右臂序列比对（R3）五、TALEN质粒活性检测细胞培养、铺板准备（MEFs、3T3-L1）FugeneHD共转染eGFP-Puro质粒（24H—48H？）嘌呤霉素筛选（killcurve）收集剩余细胞，抽提基因组DNA设计PCR引物（打靶位点附近）、PCR靶向基因片段PCR产物测序活性检测确定TALE