4 实验三 石蜡切片技术-取材、固定.

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1、石蜡切片法q以石蜡作包埋剂，用旋转切片机将材料切成薄片，经一系列处理制成永久制片的方法。q在研究植物细胞、组织、胚胎以及形态等方面最理想的制片方法。显微切片技术产生的原因§1、光学显微镜发展到一定程度，渴望知道细胞结构§2、由于组织太厚，光线很难穿过§3、压片可使组织变薄，但引起变形、易位，除核外，看不到其他结构，因此需要切片变薄。§4、因细胞水多，太软，无法切片鉴于上述情况找到一种方法使细胞水被替代，变硬，能直接切片的方法，最广泛使用的就是石蜡切片技术石蜡切片技术的优点l1、经济,价格低，可反复使用；l2、技术难度不大，容易掌握，

2、但要精通也不容易；l3、设备要求不高；l4、可长期保存；l5、染色容易，而且都能被染色，形成好的反差和好的选择性。石蜡切片法步骤一、取材二、固定三、抽气四、冲洗五、脱水六、透明七、浸蜡与包埋八、切片九、染料与染色材料的选择、采集与分割十、封藏Ø取样前应注意的问题1.研究正常结构时，应选择健全而具有代表性的部位取材；采取病理材料时，除取其病变的部位外，还应从病变的中央部分向四周，连同正常组织一起采取，以利观察分析。2.采取标本前，要根据制片的要求，选择并配制固定液，取材后应立即投入固定液，以防组织自溶和腐败。选材q植物材料的切取：根、

3、茎类轴性器官的切取：1、横切面：观察各种组织的横切面，及其所占比例。垂直于长轴方向切取。2、纵切面：观察各种组织的纵切面，平行于长轴方向切取。分为：径向切面和切向切面。选材q叶的切取：横切面。3.切取材料时，刀必须锐利，动作要快但要仔细，切割时切勿拉锯式的来回切取，镊取时须轻夹轻放，尽量不损伤材料。4.材料尽可能新鲜，并切成所需的大小。这样有利于固定液的透入。5.取材时要详细记录日期、采集地点、标本名称、时期、取材部位、断面和固定液等。Ø样品采集与分割1、叶取样部位取样部位玉米叶2、根主根侧根不定根一级侧根二级侧根根尖分区根的初生构

4、造有丝分裂、核型分析3、茎4、花Ø花药的发育孢原细胞Ø胚囊的发育单核胚囊第一次有丝分裂二核胚囊第二次有丝分裂四核胚囊八核胚囊Ø植物材料的分割取材q根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。q所采集材料应立即放入固定剂，并编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位，所取组织块要大小适当，即要能说明问题，又要考虑固定剂的穿透能力。q一般组织学取材稍大，细胞学取材稍小，植物组织取材稍小，动物组织取材要稍大。动物的麻醉和杀死从活的动物体上采取材料不象采集植物材料那么容易，因为在不施加麻醉的情况下

5、，有的动物会收缩(如蚯蚓、水蛭)，有的会骚动(如蛙、鼠)，使我们无法下手。但制片所需的材料又要求越新鲜越好，尤其是细胞学方面的研究对材料的新鲜程度要求更严。因此，要割取生活着的动物组织，在一般情况下，就要对动物施行麻醉，然后再割取材料加以固定。但是，所用的麻醉药品，必须以不影响细胞结构为原则。若是一般的组织学制片，要求不太严格的话则可将动物先杀死然后速取其组织进行固定。蛙、蟾蜍、鼠等较小的动物，可用断头法杀死，即用普通剪刀剪断颈部。较大的动物，如大竺鼠、免、猫等可用木槌猛击头后部，使其昏倒，或用50m1的注射器从耳静脉向心脏注入空气

6、，使动物发生急性空气栓塞痉挛而死。q上述动物若需麻醉后取材，则可用脱脂棉球蘸氯仿或乙醚、置于动物的鼻尖部，令其吸入麻醉。大动物(狗、猴等)应用氨基甲酸乙酯作静脉注射麻醉．剂量一般为每kg动物体重用1g。麻醉后的动物也需放血后进行取材固定。q昆虫等小动物可投入充满氯仿或乙醚蒸气的大口瓶中，令其麻醉。若要杀死，可将其投入含氰化钾的毒瓶中。动物组织块的切割割取动物组织块时，需注意以下几点：q第一，要考虑所取材料应包括各脏器的重要结构或全部结构，如消化管就应包括粘膜、粘膜下层、肌层和外膜四层结构。若所取的器官太大，不易全部制片时，则可切取能

7、代表该器官的部分材料，如狗的肾脏，可切取包括皮质、髓质和肾盂的一部分为材料。q第二，应注意切割方向．如在管状器官(肠等)取材时，一般是取其横切面制片，但要观察小肠的环行皱壁时，就应取其纵切面制片。第三，组织块必须切得小而薄。细胞学制片的组织块不能超过2mm，一般组织块的大小以0.5*0.5*0.2cm为宜，柔软组织不易切小,可先取稍大的组织块固定2-3h。等组织稍硬后再切成薄的小块继续固定。植物材料的取材：1.固定前对材料要进行切割：原因：（1）为了固定更容易为保证下一步固定材料能迅速的杀生和固定，务必使各细胞立刻停止生命活动，而不

8、使原生质有崩解的现象。普通应用的固定液对于植物体外表面的角质、木栓质等的穿透很慢，但对于被切割的表面，则穿透速度快很多。所以，我们在固定材料的时候，应将所需要的部分分割到最小块、段或片、以达到立刻杀生与固定的目的。（2）石蜡块也有一定