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《胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、胱硫醚β-裂解酶的表达纯化及性质研究侣与生物互程2011,Vo1.28No.9Chemistry&Bioe~ngineeringdoi:10.3969/j.issn.1672—5425.2011.09.007胱硫醚裂解酶的表达纯化及性质研究曹珊珊.牛卫宁,羊梦林.钦传光(西北工业大学生命学院,陕西西安710072)摘要:通过PCR从大肠杆茵(E.coliK12)基因组DNA中扩增出胱硫醚裂解酶(Cystathioninelyase,CBL)基因,构建了能高效表达CBL的重组茵E.coliBL21(pETDuet-I—CBL).重组茵在
2、3O℃,0.5mmo1.L-1IPTG存在条件下诱导9h,可溶性CBL的表达量达18mg?L～,占到茵体可溶性总蛋白的23.将重组茵超声破碎后上清液经His—TrapFastFlow亲和层析一步纯化得到CBL,回收率为71,纯度达到94,纯化后的CBL单位酶活为134.6U?mg_..为防止CBL溶液冻融后发生聚沉,向纯化后的酶液中加入5甘油,一2O℃保存.重组酶的最适反应温度为35℃,酶活性稳定的温度范围为2O～35℃.重组酶的最适反应pH值为8.0,4℃下在pH值8.0的缓冲溶液中保温10h酶稳定性最高.重组酶的K值为3.78mmo1.L
3、_.,Vm.,L-~"值为0.928mmo1.L-1?h_..本研究建立了基于CBL催化反应产物丙酮酸与2,4一二硝基苯肼显色原理测定CBL酶活性的新方法.关键词:胱硫醚裂解酶;大肠杆菌;表达纯化;酶活性测定;同型半胱氨酸中图分类号:Q786文献标识码:A文章编号:1672—5425(2011)09—0027—05同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy),又称高半胱氨酸,是一种含巯基的氨基酸,是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中的重要中间产物.研究表明,Hcy是导致心脑血管疾病,糖尿病以及神经系统疾病的危险因素[1],因此,快速准确检测Hcy
4、含量方法的建立,对基础研究和临床诊断都有非常重要的意义.目前,同型半胱氨酸最主要的检测方法包括高效液相色谱法,荧光偏振免疫法,毛细管电泳一质谱联用法以及电化学法,这些检测方法均存在测定程序复杂,耗时,样品需要预处理以及测试仪器价格昂贵等弊端L2].因此,本实验室拟建立一种通过酶催化测定Hcy的方法,该方法具有快速,方便,灵敏,精确的特点.反应原理如下:Hcy和L一丝氨酸在胱硫醚合酶(Cystathioninesynthase,CBS)催化下生成L一胱硫醚(L-Cystathionine),L-胱硫醚又经过胱硫醚裂解酶(Cystathionin
5、e~-lyase,CBL)催化生成丙酮酸,丙酮酸在碱性条件下与2,4--"硝基苯肼反应生成棕红色产物,利用分光光度计在520nm下测定吸光度值即可得到丙酮酸含量[6],从而计算出样品中Hcy的浓度.因此,大量表达和纯化CBS和CBL并对其性质进行研究是建立酶催化法测定Hcy浓度的关键,本实验室前期已经对CBS的表达,纯化以及性质进行了系统研究.作者在此构建了高效表达CBL的重组菌E.coliBL21(pETDuet-1一CBL),一步亲和层析纯化得到CBL,并建立了一种新的CBL酶活性检测方法,同时对重组CBL的酶学性质进行了研究,为酶催化测
6、定Hcy方法的建立奠定了基础.1实验1.1材料1.1.1菌种和试剂大肠杆菌E.coliK12,E.coliDH5a,E.coliBL21,自行保存.质粒pETDuet一1,Novagen公司;质粒DNA抽提试剂盒,DNA胶回收试剂盒,Omega公司;TDNA连接酶,TaqDNA聚合酶和各种限制性内切酶,蛋白Marker,TaKaRa公司;L一胱硫醚标准品,Sigma公司;HisTrapFastFlow(1mL)预装柱,基金项目:国家自然科学基金资助项目(20802057),陕西省科技攻关计划项目(2011K08—12),西北工业大学"翱翔之星
7、"计划项目,西北工业大学基础研究基金资助项目(JC2O1161)收稿日期:2011一O7—16作者简介:曹珊珊(1988--),女,山东聊城人,硕士研究生,主要从事药物化学研究;通讯作者:牛卫宁,副教授,E-mail:niuweining@nwpu.edu.cn.GE公司;其余试剂均为国产或进口分析纯.1.1.2培养基LB培养基:0.59/6酵母粉,1蛋白胨,1氯化钠,氨苄青霉素(Ampicillin)终浓度为50g?mL.1.2方法1.2.1重组菌E.coliBL21(pETDuet一1一CBL)的构建以大肠杆菌E.coliK12的基因组D
8、NA为模板,通过PCR扩增获得CBL基因片段,上下游引物分别为:5一CTCGGGATCCGCGGACAAAAAGCTTG—ATACTC一3和5f_CAGTGCGGC
