植物抗旱生理指标测定原理及方法

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1、植物抗旱生理指标测定原理及方法生命科学学院杨歌指标测定:一、可溶性糖(蒽酮法)二、脯氨酸三、丙二醛四、叶绿素五、蛋白(考马斯亮蓝法)六、超氧化物歧化酶(SOD)七、过氧化物酶(POD)八、谷胱甘肽(GSH)九、电导率一、可溶性糖含量的测定1.蒽酮法1.1原理糖在浓硫酸作用下,可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛,生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物,在可见光吸收峰位620nm。测定对象:几乎可以测定所有的碳水化合物,而且可以测所有寡糖类和多糖类,其中包括淀粉、纤维素等(反应液中的浓硫酸可以把多糖水解

2、成单糖而发生反应,所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量,实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量)。1.2步骤试剂:(1)浓硫酸;(2)蒽酮乙酸乙酯试剂:蒽酮------------1g加乙酸乙酯至----50ml实验步骤:(1)称取样品0.1g,置于研钵中,加4mlddH2O研磨成匀浆,8mlddH2O洗涤研钵。(2)100°C沸水浴10min,冰上冷却。(3)4000rpm离心10min。(4)取上清5ml转移至100ml容量瓶定容。(5)1ml提取液+1mlddH2O+0.5ml蒽酮+5ml浓硫酸,轻轻混合均匀,

3、100°C沸水浴10min,冰上冷却。(6)620nm处测吸光值。1.3计算方法可溶性糖含量% = C*V/(W*10^6)*100% V为植物样品稀释后的体积(ml)------100mlC为提取液的含糖量(μg/ml)--------根据标准曲线计算W为植物组织鲜重量(g)-------------0.1g问题及质疑:1.目标糖含量:标准曲线是用葡萄糖位标准制作的,而蒽酮法是测总糖的量,包括己糖、戊糖,浓硫酸将淀粉、纤维素水解成的单糖,将总糖得出的OD值代入由单一糖做出的标准曲线,有一定误差存在。注:查看所

4、有文献的标准曲线都是用葡萄糖制作。2.误差分析:(1)不同糖类与蒽酮试剂反应的显色程度不同。果糖最深,葡萄糖次之,半乳糖、甘露糖较浅,五碳糖最浅造成误差。(2)蒽酮试剂溶解度较低,非常容易析出,在反应时加入糖的水溶液中,出现浑浊现象,影响反应进行。(3)介于以上原因,将上清5ml转移至100ml容量瓶定容,稀释程度过大,当糖含量少的时候,大的误差可能会掩盖真实的糖含量。造成品数据没有实际意义。方案修改意见:1.首先,做五到六组空白,测试分光光度计误差程度。2.增加平行组数,由三组增加至五组,减少每个样品测试次数。

5、3.改变测试样品定容量,由100ml变为50ml。脯氨酸含量的测定1.茚三酮法1.1原理在正常环境条件下,植物体内游离脯氨酸含量较低,但在逆境(干旱、低温、高温、盐渍等)及植物衰老时,植物体内游离脯氨酸含量可增加10-100倍,并且游离脯氨酸积累量与逆境程度、植物的抗逆性有关。用磺基水杨酸提取植物样品时,脯氨酸游离于磺基水杨酸的溶液中,然后用酸性茚三酮加热处理后,溶液即成红色,再用甲苯处理,则色素全部转移至甲苯中,色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波长下比色,从标准曲线上查出(或用回归方程计算)脯氨酸

6、的含量。1.2步骤试剂:(1)25%茚三酮:茚三酮------------0.625g冰乙酸------------15ml6mol/L磷酸--------10ml70°C水浴助溶;(2)6mol/L磷酸:85%磷酸稀释至原体积的2.3倍;(3)3%磺基水杨酸:磺基水杨酸------3g加蒸馏水至------100ml实验步骤:(1)称取0.1g样品放入研钵,加5ml3%磺基水杨酸研磨成匀浆,100°C沸水浴15min;(2)冰上冷却,4000rpm离心10min;(3)提取液2ml+冰醋酸2ml+25%茚三酮2

7、ml混合均匀,100°C沸水浴30min,冰上冷却;(4)加4ml甲苯混合均匀,震荡30s,静置30min;(5)以甲苯为空白对照,再520nm下测定吸光值。1.3计算方法脯氨酸含量(μg/gFW)=X*提取液总量(ml)/样品鲜重(g)*测定时提取液用量(ml)*10^6公式中:X-----从标准曲线中查得的脯氨酸含量(μg)提取液总量---------------------------5ml测定时提取液用量---------------------2ml问题及质疑:1.酸性体系下,脯氨酸与茚三酮加热反应后

8、的最终产物为红色,再实验过程中,仅有少数时候能发现红色产物。原因有待确定。2.经查看文献资料,反应步骤已经是优化的,没有问题。甲苯萃取脯氨酸与茚三酮的反应产物,消除了多余未反应的茚三酮,磺基水杨酸,提取液中其他杂质(如色素)以及PH变化的干扰。3.根据茚三酮与脯氨酸的缩合反应分析:(1)反应体系的PH控制很重要,保持酸性环境,否则,反应产物的最大吸光值并不在520nm。(

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