细胞凋亡的检测方法

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1、细胞凋亡的检测方法细胞凋亡与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。1、细胞凋亡的形态学检测：根据凋亡细胞固有的形态学特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。a、光学显微镜和倒置显微镜观察：未染色凋亡细胞体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落；染色凋亡细胞常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分

2、割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。b、荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜：一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况，常用的DNA特异性染料有：有HO33342（Hoechst33342）,HO33258(Hoechst33258),DAPI。三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。Hoechst是与DNA特异结合的活性染料，储存用蒸馏水配成1mg/ml的浓度，使用时用PBS稀释成终浓度一般为2-5ug/ml。DAPI为半通透性，用常规固定细胞的染色。储存液用蒸馏水溶解为浓度1mg/ml，使

3、用终浓度一般为0.5-1ug/ml。结果评判：细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：Ⅰ期的细胞核呈波纹状（rippled）或呈折缝样（creased）,部分染色质出现浓缩状态；Ⅱa期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；Ⅱb期细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。c、透射电子显微镜观察。结果评判：凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象（cavitations）的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。2、磷脂酰丝氨酸外翻分析：磷脂酰丝氨酸（Phosphatidyllse

4、rine,PS）正常位于细胞膜的内侧，但在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为35-36KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。碘化丙啶（propidineiodide,PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将An

5、nexin-V与PI匹配使用，就可以将凋亡早晚期的及死细胞区分开来。方法：a、悬浮细胞的染色：Ⅰ、将正常培养和诱导凋亡的悬浮细胞（0.5×106）用PBS洗2次，加入200μlBindingBuffer和FITC标记的Annexin-V(20ug/ml)10μl及PI(50ug/ml)5μl,室温避光30min,加入400μlPBS，立即用FACScan进行流式细胞术定量检测（一般不超过1小时），同时以不加AnnexinV-FITC及PI的一管作为阴性对照。Ⅱ、贴壁培养的细胞染色：先用0.25%的胰酶消化，洗涤、染色和分析同悬浮细

6、胞。Ⅲ、爬片细胞染色：同上，最后用荧光显微镜和共聚焦激光显微镜进行观察。结果及注意事项：整个操作动作要尽量轻柔，勿用力吹打细胞；操作时注意避光，反应完毕后尽快在一个小时内检测；3、线粒体膜势能（△ψmt）的检测：多种细胞凋亡诱导不同的细胞凋亡时，皆发生线粒体跨膜电位△ψmt的下降，并且发现△ψmt下降是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件，在细胞核出现凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）之前，还发现一量线粒体△ψmt崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如Rhodamine123、3,3-Dihe

7、xyloxacarbocyanineodide[DiOC6(3)]echloro-tetraethylbenzimidazolcarbocyanineiodide[JC-1]、Tetramethylrhodaminemethylester(TMRM)等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。方法：将正常培养的细胞和诱导凋亡的细胞加入使用终浓度为Rhodamine123(1μM)终浓度为DiOC6(25μM),JC-1(1μM),TMRM(100μM),37℃平衡30min,流式细胞计检测细胞的荧光强

8、度。结果及注意事项：始终保持平衡染液中PH值的一致性，因为PH值的变化将影响膜电位。与染料达到平衡的细胞悬液中如果含有蛋白，他们将与部分染料结合，降低染料的浓度，引起假去极化。4、DNA片断化检测：细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩，染色