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1、RNA干扰技术在肿瘤基因治疗中的应用进展[摘要]RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是指由双链RNA(double-strandRNA,dsRNA)引发的转录后基因沉默机制(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS),具有序列特异性和高效性,RNAi作为一门新的基因阻断技术,是一种有广阔应用前景的抗肿瘤基因治疗方法,近年来受到人们的广泛关注。本文将RNAi作用机制及其在肿瘤治疗中的研究进展作一综述。[关键词]RNA干扰；基因治疗；肿瘤RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术,也称为基因沉寂疗法(GeneSilencin
2、g),是利用双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)诱发对宿主细胞特异性RNA转录的抑制,从而抑制特异目的基因表达的方法。也即双链RNA在细胞内RNA酶Ⅲ的作用下,被裂解成21～23个核苷酸(nucleotide,nt)的小干扰性RNA(smallinterferenceRNA,siRNA),进而启动细胞内RNAi反应,特异性地阻断靶基因表达的过程。此技术在功能基因组研究和抗肿瘤、抗病毒治疗方面得到了广泛应用。本文综述RNAi技术及其在肿瘤基因治疗方面的研究进展。1RNAi现象的发现早在1995年Guo和Kemphues在用反义RNA研究华丽新小杆线虫(C.eleg
3、ans)par1基因功能时,意外地发现了反义和有义RNA混合物能更显著地抑制特定基因的功能[1]。1998年Fire对此进行了深入研究,他将针对特定基因的双链RNA(dsRNA)注射入华丽新小杆线虫,同样抑制了特定基因产物的表达,而且针对靶基因的dsRNA可产生较反义RNA更强的基因阻抑效应。由于这是一种在RNA水平的基因表达抑制,因而Fire将此现象命名为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)[2]。随后在许多生物中相继发现存在RNAi现象,如果蝇(drosophila)、线虫(caenorhabditiselegans)、锥虫(trypanosomes)等[3]。直到
4、最近人们才发现在植物中被称为共抑制(cosuppression),真菌中被称为抑制(Quelling)的现象与动物中RNA干扰(RNAi)具有很大的相似性,都与转录后基因沉默现象(post-transcriptionalgenesilencing,PTGS)有关[4]。PTGS是生物在长期进化过程中产生的抗病毒感染、保持基因组中转座子和其它可转移核酸稳定性的防御系统,并在某些生物生殖细胞的发育过程中起重要作用。研究发现从低等生物到高等生物中都存在RNAi现象,提示RNAi可能是一种进化上保守的基因组水平的免疫监控机制[5]。2RNAi的作用机制自RNAi现象发现以来,许多研究者对其作用机
5、制进行了大量研究,现在普遍认为其可能机制为:(1)启动阶段:长dsRNA进入细胞被切割成21～23个核苷酸组成的片断,即小干涉片断(siRNA)。切割细胞内双链RNA的酶是一种被称为Dicer的核酸内切酶,Dicer酶是RNaseⅢ家族成员之一,带有2个催化结构域、1个螺旋结构域和1个PAZ结构域,外源dsRNA被Rde-1编码蛋白识别后与Dicer结合形成Dicer-dsRNA复合物,Dicer酶的RNase活性作用将长双链RNA变成siRNA从而引发RNA干扰的能力[6,7],Dicer酶在RNAi的调控途径中起着关键作用。(2)效应阶段:siRNA形成后与RNAi特异性酶Ago-2
6、等结合,形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),RISC经ATP酶激活后,与之结合的双链siRNA开始变性并解旋、解链,在siRNA指导下序列特异性降解与siRNA同源的靶mRNA,达到阻止靶基因表达,使基因沉默的目的[8]。(3)扩增阶段:在研究中人们发现小剂量的dsRNA分子就足以引起整个机体同源基因表达的抑制,而且能够将基因沉默的信息传递给下一代。这种作用被认为是在一种RNA介导的RNA聚合酶(RNA-directedRNApolymerase,RdRP)的作用下,以siRNA中的一条链为引物,靶mRNA为模板合成dsRNA的
7、聚合酶链式反应[9,10],后者又被降解形成新的siRNA重新进入上述循环,使干扰信号放大,从而引发强大的RNA干扰作用。进一步的研究发现RdRP有3个同源体,其中,RrpA是RNAi所必须的酶,dsRNase作用下产生的小量siRNA作为RrpA扩增引物,以靶mRNA为模板合成dsRNA,后者再被dsRNase降解为siRNA而进入新的扩增循环使RNAi效应放大[11]。3RNAi作用的特点3.1高序列特异性[12]RNAi是转录
