taqmanmgb探针检测慢性骨髓增殖性疾病患者的jak2v617f突变

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1、TaqmanMGB探针检测慢性骨髓增殖性疾病患者的JAK2V617F突变作者：孙雪梅,徐祖琼,于慧,赖仁胜,谢玲,顾香芳,夏珺,李建勇【摘要】　　目的:采用不同方法检测慢性骨髓增殖性疾病（CMPD）患者的JAK2V617F突变率,评估临床应用的可能性。方法:提取84例Ph阴性CMPD患者单个核细胞DNA,利用RealtimePCR联合TaqmanMGB探针检测骨髓增殖性疾病患者的JAK2V6A7F的发生率,并利用限制性片段长度多态性（RFLP）对照检测CMPD患者的JAK2V617F突变率,用基因测序验证两种结果。结果:RealtimePCR联合TaqmanMGB探针检测84例Ph（-）

2、CMPD患者,42例存在JAK2V617F,突变率为50%;其中PV、ET、IMF患者的突变率分别为76.7%（23/30）、25.9%（7/27）、42.5%（9/20）,经RFLP检测84例Ph（-）CMPD总的突变率为33.3%,测序结果验证了RealtimePCR联合TaqmanMGB探针检测结果。结论:TaqmanMGB探针联合RealtimePCR方法有较高的准确率,可以作为检测JAK2V617F突变的方法。【关键词】慢性骨髓增殖性疾病;JAK2突变;检测方法　　慢性骨髓增殖性疾病（CMPD）是以骨髓过度增殖为特点的一类疾病,9Ph阴性CMPD包括真性红细胞增多症（PV）、慢性

3、特发性骨髓纤维化（CIMF）、原发性血小板增多症（ET）、不能分类的骨髓增殖性疾病（CMPDU）和慢性嗜酸性粒细胞白血病（CEL/HES）等。2005年开始多个研究小组发现Ph阴性CMPD患者中存在JAK2V617F突变［1,2］,功能研究以及模式动物研究显示该突变可引起JAK2激酶及下游信号通路的持续活化,导致细胞恶性增殖和凋亡抑制［3］。最新的WHO诊断标准强调了JAK2V617F突变的重要性,JAK2V617F应用于临床诊断要求有简便而灵敏的检测方法［4］。TaqmanMGB探针是一种新型检测单核苷酸多态性的探针,我们利用这种探针联合RealtimePCR方法5检测CMPD患者的JA

4、K2V617F突变率,并与限制性片段长度多态性以及基因测序相比较,以寻找一种方便快捷的检测手段。　　1材料和方法　　1.1材料　　84例Ph阴性CMPD患者,中位年龄51岁,其中PV30例,ET27例,IMF20例,CMPDU7例,其中男47例,女37例,6例骨髓移植供者作为正常对照,中位年龄为32岁,男3例,女3例。诊断标准符合2001年WHO标准［6］。　　1.2.1样本收集和单个核细胞分离　　患者外周血或者骨髓经肝素抗凝后收集,9外周血经上臂静脉、骨髓经髂前上棘或髂后上棘采集。利用人淋巴细胞分离液分离外周血/骨髓单个核细胞。　　1.2.2JAK2V617F突变检测　　提取单个核细胞DN

5、A,保存于-20℃;利用紫外分光光度计检测DNA浓度;利用RealtimePCR联合TaqmanMGB探针检测样本JAK2V617F突变:MGB探针:FAMCCACAGACACATACTMGB;TETCCACAGAAACATACTCMGB;Taq引物:FP:5TGCTCTGAGAAAGGCATTAGAAAG3;RP:5GCAGCAAGTATGATGAGCAAGC3;按下列体系加样（20μL体系）:2×HoTaqPCRReactionMix10μL,探针mix（10μmol/L）0.6μL,引物mix（20μmol/L）0.5μL,模板（25mg/L）2μL,ddH2O水6.7μL。反

6、应条件:2min50℃、10min95℃,30s95℃,34s62℃,50个循环。利用AppliedBiosysterm软件观察结果。限制性片段长度多态性检测JAK2V617F突变:利用引物F:5′GGGTTTCCTCAGAACGTTGA3′;R:5′TCATTGCTTTCCTTTTTCACAA3′经PCR扩增样本DNA,扩增出的DNA片段经提纯后利用BsaⅪ酶酶切,利用琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。比较上述两种方法检测的结果,将结果不同的样本DNA经PCR扩增后送基因测序。　　1.2.3统计学分析9　　使用SPSS10.0软件,利用配对卡方检验以及Kappa检验,比较两种检测手段的检出率。　　2

7、结果　　2.1TaqmanMGB探针联合RealtimePCR检测结果　　84例PhCMPD患者中有42例患者有突变,突变率为50%。其中30例PV患者中有23例患者有突变,其中两例为纯和突变,其余21例为杂合突变,突变率为76.7％（23/30）;27例ET患者中有7例患者有突变,均为杂合突变,阳性率为25.9％（7/27）;其余患者无突变。20例IMF患者中有9例患者有突变,均为杂合突变,突