实时荧光定量pcr技术检测儿童hbvdna载量

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1、实时荧光定量PCR技术检测儿童HBVDNA载量作者：杨继青，李祚品，廖明凤，陈丽艳【摘要】目的:研究儿童HBVDNA及血清学标志物与乙肝病毒复制的关系，探讨其应用在儿童乙型肝炎患者的临床价值。方法:实时荧光定量PCR测定HBVDNA;ELISA法酶联免疫吸附法检测血清标志物;速率法检测丙氨酸转氨酶(ALT),综合分析并评价其相互关系及临床联合检测的价值。结果:HBsAg+、HBeAg+、抗HBc+阳性组125例，检出125例，检出率100%，含量为5.26×106~2.19×108拷贝/ml，ALT35例增高,占28

2、%;HBsAg+、抗HBe+、抗HBc+阳性组55例，15例被检出，检出率为27.3%,含量范围2.53×103~1.29×106拷贝/ml，ALT10例增高,占18%;HBsAg+、抗HBc+阳性组10例，检出1例，检出率10%，含量3.19×103拷贝/ml。结论:儿童乙型肝炎患者HBeAg阳性组HBVDNA载量较高，是否与其生理发育不够完善，机体免疫力低下，对病毒的抵抗力较弱有关。抗HBe阳性组相对复制水平较低，与成人差异无显著，HBVDNA载量与ALT水平高低无相关性，乙肝病毒含量的高低与肝功能受损程度不呈正相

3、关。【关键词】儿童;HBVDNA;乙肝标志物;丙氨酸转氨酶6乙型肝炎(HBV)是我国最为常见的感染性疾病之一，目前临床上主要是对成人HBV患者的HBVDNA与血清标志物研究较多，而专门对儿童HBV患者进行HBV病毒DNA与血清标志物的研究则相对较少。为了解儿童HBV患者HBVDNA载量与HBV血清标志物(HBVM)的关系，检测抗病毒治疗的有效性，我们采用目前最先进的实时荧光定量PCR技术检测患儿的HBVDNA载量及HBVM与ALT同时进行检测。实时荧光定量PCR技术与常规PCR技术相比，其具有特异性更强、能有效解决

4、PCR产物污染问题、准确度高、自动化程度高等特点［1］。我们对本院190例HBV患儿同时进行了HBVDNA、HBVM和ALT的测定。探讨不同免疫标志物的儿童HBV患者的血清中HBVDNA水平及临床价值以及它们之间的相互关系，为临床提供更科学的治疗依据。　　1材料和方法　　1.1标本来源　　190例儿童HBV患者均来自我院感染科及儿科，空腹12h，一次性真空采取静脉血4ml。临床诊断标准均参照2000年全国病毒性肝炎学术会议修订的《病毒性肝炎防治方案》，并经临床及实验室检查排除甲、丙、丁、戊等肝炎，为首次确诊患儿，其中男

5、童101例，女童89例，年龄2岁~14岁，平均年龄9岁。10份对照血清均选自儿童体检者，HBVM五项全为阴性，ALT水平均小于40u/L。6　　1.2试剂和仪器试剂　　HBVDNA采用实时荧光定量PCR法，试剂盒由广州中山大学达安基因股份有限公司提供；条件为:93℃预变性2min，93℃变性5s，57℃退火45s，共40个循环。HBVM采用ELISA法，ALT采用速率法，二者试剂均为上海荣盛生物技术有限公司提供。仪器，扩增仪：瑞士Roche公司LightCyclerTM全自动荧光定量PCR分析仪，仪器数据处理软件5.32

6、版;生化仪：美国雅培全自动生化分析仪(AEROSET)；酶标仪TecanSunrist；洗板机：LabsystemsWenwash4MK2。所有检测项目均严格按照试剂盒说明书操作，HBVDNA设有阴性对照、强阳性对照、临界阳性对照、质控物和104~1074种阳性参考品,所有样本同时扩增,得出所测样本中的载量值用拷贝/ml表示。每次试验中，阴性对照的Ct值(循环阈值)不显示任何数值，阳性参考品的标准曲线的r值介于-0.98~-1。试剂检测下限为1×103拷贝/ml，HBVM:设有阴性、临界阳性和强阳性对照。ALT:设有高、

7、中、低三种质控物。　　1.3统计学处理　　采用χ2检验和t检验,P<0.05为差异有显著性。　　2结果　　HBsAg+HBeAg+抗HBc阳性组125例，HBV6DNA检出125例，检出率为100%，范围5.26×106~2.19×108拷贝/ml,ALT增高只有35例,占28%;HBsAg+抗HBe+抗HBc阳性组55例,HBVDNA检出15例，检出率为27.3%，范围在2.53×103~1.29×106拷贝/ml,ALT增高只有10例,占18%;二者HBVDNA阳性检出率分别为100%和27.3%,差异有显

8、著性(P<0.05)。HBsAg+抗HBc阳性组10例，HBVDNA检出1例，检出率为10%，结果为3.19×103拷贝/ml，ALT增高为0例。10例儿童健身体检对照者所有检测结果均为阴性。实时荧光定量PCR技术在儿童HBV血清标志物阳性中检测HBVDNA的结果见表1。表1不同HBVM儿童H