急性呼吸道感染患儿人类博卡病毒检测与分析

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1、急性呼吸道感染患儿人类博卡病毒检测与分析作者：伍严安曾秀雅周建林付希陈发林陈发文【摘要】目的探讨人类博卡病毒（HBoV）与儿童急性呼吸道感染(ARTI)的关系。方法RTPCR检测2006年11月-2008年4月连续2个冬春季儿科418例呼吸道感染鼻咽分泌物标本的HBoV。结果HBoV阳性率为5.0%(21/418)。阳性者年龄在4月～5岁。下呼吸道感染HBoV阳性率11.1%(17/153)显著高于上呼吸道感染的1.5%(4/265)(χ2=18.741,P<0.001)。结论HBoV是本地区冬春季儿童呼吸道感染、尤其是下呼吸道感染

2、的的重要病原之一。【关键词】呼吸道感染;急性病;聚合酶链反应;细小病毒B19,人;细小病毒科感染；福州呼吸道感染是儿童高发病率和死亡率的主要原因之一。目前尚有1/3急性呼吸道感染（acuterespiratorytractinfections，ARTI）病因不明。2005年，Allander等从呼吸道感染的婴幼儿标本中分离到一种新的单链无胞膜DNA病毒，经基因序列发现其属于细小病毒科，将其暂命名为人类博卡病毒（HumanBocavirus,HBoV）[1]。10为探讨HBoV与呼吸道感染的关系，以及了解HBoV在福州地区的流行情况，本研究对

3、福州地区ARTI婴幼儿进行HBoV检测并做分析，现报告如下。1对象与方法1.1对象1.1.1研究对象收集2006年11月-2007年5月及2007年11月-2008年4月连续2个冬春季节笔者医院儿科ARTI患儿咽拭子或鼻咽吸出物标本，共418例。其中门诊264例,住院154例；男性264例，女性154例，男女比例为1.71∶1。年龄15d～14岁,年龄中位数为2.2岁。2006年11月-2007年5月上呼吸道感染134例，下呼吸道感染89例。2007年11月-2008年4月上呼吸道感染131例，下呼吸道感染64例。下呼吸道感染的临床诊断包含

4、支气管炎、支气管肺炎、毛细支气管炎、哮喘等。门诊患儿咽拭子采集时间在发病<2d，未使用任何抗病毒药物之前。住院患儿于入院当天或第2天采集。急性呼吸道感染的临床诊断标准参照文献[2]。1.1.2主要试剂及仪器病毒核酸提取试剂盒[法国生物梅里埃公司（Biomerieux）]；ExTaqDNA聚合酶、dNTP（日本TaKaRa公司）；DNAMarker（北京天庚公司）。基因扩增仪(杭州博日公司)。101.1.3引物根据文献[3]设计HBoVNP1基因引物（354bp），由大连宝生物公司合成。P1：5’GACCTCTGTAAGTACTATT

5、AC3’P2：5’CTCTGTGTTGACTGAATACAG3’1.2方法1.2.1病毒DNA提取将采集的咽拭子洗涤入装有大约0.5mL病毒保护液(含200U/mL青霉素、200U/mL链霉素、200U/mL两性霉素B及0.125%BSA)的EP管中；鼻咽吸出物标本取1mL加入含有约1mL的病毒保护液EP管中，置漩涡振荡器上充分振荡混匀，反复冻溶2次后离心取上清液。按照病毒核酸提取试剂盒说明书操作。1.2.2PCR反应10×Buffer（含Mg2＋）2.5μL，dNTPMix(2.5mmol/L)2μl，引物浓度为0.4μmol，cD

6、NA模板1μL，ExTaqDNA聚合酶0.625U，加双蒸水至终体积25μL。PCR反应条件：95℃5min→95℃30s→56℃45s→72℃45s，扩增35个循环；72℃延伸8min。扩增产物以含0.5μg/mLGoldview的1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，紫外灯下观察结果。以生理盐水为阴性对照。以最初检测到并经测序证实的HBoV阳性标本为阳性对照。101.2.3DNA测序PCR产物送大连宝生物公司测序。1.3统计学处理采用SPSS13.0软件进行统计学处理，采用ChiSquare(X2)，P<0.05为差别有统计学意义。

7、2结果2.1PCR产物电泳结果图1为PCR检测HBoV产物电泳结果，阳性产物于354bp处可见清晰条带，与预期结果相符。2.2HBoV测序结果对两个冬春季的HBoV扩增产物各抽取3份行DNA测序，结果显示6份扩增产物的核苷酸序列完全一致；与GeneBank中瑞典的HBoV原型株Stockholm1（st1，DQ000495）与Stockholm2（st2，DQ000496）一致性为99％，氨基酸同源性为100％。与北京的DQ353697（BJ3124）与DQ353699（BJ3846）序列一致性为100％。暂将其命名为FJ074115。HB

8、oV扩增产物测序结果见图2。M：100bpDNAMarker；1：HBoV阳性标本；2：阴性对照.2.3系统进化树分析结果系统进化树分析显示人类细小病毒B19自成一簇，HBoV成