凝胶迁移或电泳迁移率实验emsa技术

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1、·什么是凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)？·凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的

2、探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。EMSA原理示意图如下： ·凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA)常用的实验手

3、段有同位素32P法和非同位素法（化学发光法）。·一般做这样的实验需要什么试剂？凝胶迁移实验需要的结合蛋白，可来源于纯化或部分纯化的蛋白，或粗的核和胞质抽提液。还必须制备同位素标记的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探针用g-32P和T4多核苷酸激酶来作末端标记，同位素标记的RNA用噬菌体RNA聚合酶和同位素标记的核苷酸在体外合成。结合反应所需的组分有：含盐的溶液（氯化镁，氯化钠，或氯化钾）、缓冲体系（Tris-HCl或HEPES）、还原剂（DTT）、甘油、非特异的竞争DNA（poly(dI:dC)(dI:dC)），也可能含

4、非离子去污剂。在结合蛋白和同位素标记的探针作用后，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物，随后将凝胶干燥并放射自显影，或用PhosphorImage分析。 ·成功进行凝胶迁移实验，需要优化哪些因素？凝胶迁移实验在理论上很简单也很快速，但要成功地进行凝胶迁移实验，需要优化一些参数，这主要受结合蛋白的来源和探针结合位点特点的影响。以下是需要优化的因素：抽提液的制备（核酸酶和磷酸酶污染会使探针降解），结合蛋白的浓度，探针的浓度，非特异性探针的浓度，缓冲液的配方和pH,聚丙烯凝胶电泳的特点和电泳条件，保温时间和温度，载体蛋白，是否

5、有辅助因子（比如锌，或镉等金属离子，或激素）。总之，反应总体积应最小（20uL）。为满足一般要求，结合缓冲液含4%甘油，1mMMgCl2,0.5mMEDTA,0.5mMDTT,50mMNaCl,10mMTris-HCl(pH7.5),0.05mg/mLpoly(dI:dC)?dI:dC,或10mMHEPES(pH7.9),50mMKCl,1mMDTT,1mMEDTA,10%甘油，0.05mg/mLpoly(dI:dC)?dI:dC可作为优化实验的起始。 ·常用的同源的多核苷酸引物，这些引物的序列来源是什么？有各类dsDNA

6、探针，它们含各种转录调控因子的同源结合位点。下表列出了所能提供的探针，和这些引物序列的出处。转录调控因子探针探针名/目录号/序列（上链）/序列的出处Sp1/E3231E3232/5`-ATTCGATCGGGGCGGGGCGCG-3`/SV40启动子（1）AP1/E3201E3202/5`-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3`/胶原酶基因TRE（2）AP2/E3211E3212/5`-GATCGAACTGACCGCCCGCGGCCCGT-3`/人金属硫堇IIa（3）基因NF-kB/E3291E3292/5`-AG

7、TTGAGGGGACTTTCCCAGGC-3`/鼠Igk轻链基因（4）Oct1/E3241E3242/5`-TGTCGAATGCAAATCACTAGAA-3`/Ig重链基因（5）CREB/E3281E3282/5`-AGAGATTGCCTGACGTCAGACAGCTAG-3`/大鼠生长激素抑制基因（6）TFIID/E3221E3222/5`-GCAGAGCATATAAGGTGAGGTAGGA-3`/belta-1球蛋白启动子注：只列出了上链的序列，探针是双链，下链序列和上链序列配对。粗体字表明序列来源于指定的基因序列，转录

8、调控因子结合的序列用下线表明。一般而言，周围的核苷酸是任意。·在DNA探针的选择上，要考虑哪些重要因素？目的DNA的长度应小于300bp，以有利于非结合探针和蛋白DNA复合物的电泳分离。双链的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝胶迁移实验中用作探针。如目的蛋白已被鉴定，则应用短的寡核苷酸片段（约为25b