酶工程《生物技术与生活》《生物技术概论》课件 视图选择纯黑白即可使用课件

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1、酶•定义：一种生物催化剂，具有作用专一性强、催化效率高等特点，能在常温常压和低浓度条件下进行复杂的生化反应。包括核酶及蛋白质酶。酶工程酶工程酶工程•定义利用酶的特异催化功能，将一种物质转化为另一种物质的技术.优良产酶菌种的筛选•基本步骤采样→菌种分离→产酶性能测定→复筛酶工程酶工程基因工程菌的构建产生目的酶的生物酶的纯化总mRNA的纯化cDNA测定部分氨基酸序列mRNA合成寡核苷酸探针克隆到Ecoli中，建立cDNA文库转入工业生产用宿主（工程菌）鉴定cDNA克隆子酶的工业化生产•定义在人工控制的条件下，有目的地利用微生物培养来生产所需的酶。•包括培养基的选择发

2、酵方式的选择发酵条件的控制管理酶工程微生物酶的发酵生产培养基•碳源淀粉、糖蜜、蔗糖等。•氮源有机氮（豆饼粉、花生饼粉）、无机氮•无机盐类低浓度有利于酶产量的提高，有些金属离子是酶的组分。•生长因子细胞生长必需的微量有机物，如维生素、氨基酸、嘌呤碱、嘧啶碱。•pH值应根据微生物的需要调节pH值。酶工程•固体发酵用于真菌的酶生产。方法简单，但操作条件不易控制。•液体深层发酵关键是对温度、通气、搅拌和pH的控制。产品回收和提纯工艺简便。酶的发酵生产方式酶工程•添加诱导物分为①酶的作用底物；②酶的反应产物；③酶底物类似物。•降低阻遏物浓度措施：分次添加碳源、产物类似物可

3、解除反馈阻遏。•表面活性剂肥离子型表面活性剂常被用作产酶促进剂。提高酶产量的措施酶工程•工业用酶一般无需高度纯化，如洗涤用蛋白酶。•食品工业用酶需适当的分离纯化，以确保安全卫生。•医药用酶需经过高度纯化，不能含有热源物质。酶工程酶的分离纯化基本原则提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌；要求在低温下操作；低盐浓度；操作中加入缓冲溶液；防止微生物的污染。酶工程酶的分离纯化酶工程酶制剂的制备•破碎细胞对胞内酶的提取。有机械破碎法、酶法、化学试剂法、物理破碎法。•溶剂抽提稀酸、稀碱、稀盐溶液。•分离离心机、板框压滤机。•浓缩吸附、沉淀、凝胶过滤

4、、真空薄膜浓缩。•干燥固体酶比液体酶保存时间长。常用方法有真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥。酶工程酶的纯化与精制根据分子大小和形状•离心分离•凝胶过滤•透析与超滤根据酶分子电荷性质•离子交换层析•层析聚焦•电泳•等电聚焦•凝胶过滤指混合物随流动相经过固定相(凝胶)的色谱柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。又称分子筛色谱。酶工程•组成上的特点固定相（凝胶）是一种不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒的细微结构就如一个筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于凝胶颗粒之外，因而具分子筛的性质。又因整个色谱过程一般不变换洗脱液，

5、好象过滤一样，故称凝胶过滤。凝胶过滤凝胶过滤分离示意图（1）样品溶液加在色谱柱顶端；（2）样品溶液流经色谱柱，小分子通过扩散作用进入凝胶颗粒的微孔中，而大分子则被排阻于颗粒之外。大、小分子因向下移动的速度发生差异而被分离开来；（3）向色谱柱顶加入洗脱液，大、小分子分开的距离增大；（4）大分子已经流出色谱柱凝胶过滤•透析其特点是半透膜两边都是液相，一边是试验液，另一边是纯净溶剂（水或缓冲液）。试验液中不可透析的大分子被截留于膜内，可透析的小分子经扩散作用不断透出膜外，直到两边浓度达到平衡。透析法多用于制备及提纯生物大分子时除去或更换小分子物质、脱盐和改变溶剂成分。

6、酶的分离方法透析袋简单装置酶的分离方法加正压在膜两边产生压差的方法产生负压的分子得以分离。酶的分离方法•超滤原理加压膜技术之一，与一般过滤一样，主要依赖于被分离物质分子量的大小、形状和性质不同，在一定的压力差（外源N2或真空泵压）下，使小分子能够通过具有一定孔径的特制薄膜，限额以上的大分子被膜阻留，使不同大小超滤示意图超滤•离子交换层析法原理离子交换树脂是一种具有离子交换能力的高分子化合物，不溶于水、酸、碱及普通有机溶剂，化学性质稳定。由两部分组成：树脂的骨架(R)，是多价高分子基团，具不溶于水的网状结构；交换基（可扩散离子），具有可交换的离子活性基团，这两部分

7、带有相反电荷。组成固定相:离子交换树脂流动相:需要分离的溶液酶的分离方法R-M++H+A-R+A-+M+OH-离子交换法•阳离子树脂可扩散离子是阳离子H+R-+M+A-•阴离子树脂可扩散离子是阴离子R+OH-+M+A-⎯⎯→交换剂表面⎯⎯→交⎯⎯→交换剂表⎯⎯→溶液中离子交换层析包括吸附、吸收、穿透、扩散、离子交换、离子亲和等过程，是综合作用的结果。溶液中离子换剂颗粒内与交换剂中可扩散离子交交换出来的离子换面扩散扩散扩散散离子交换法•交换过程酶工程酶活力•酶活力酶催化一定化学反应的能力。通常用国际单位表示：以最佳条件或某一固定条件下每分钟催化生成1μmol产物所

8、需要的酶量为一个酶活力单