人cbl 基因真核表达载体的构建及表达

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1、人cbl基因真核表达载体的构建及表达【Abstract】AIM：ToconstructtheeukaryoticexpressingvectorofhumancblandtestitsexpressioninAfricangreenmonkeykidneycelllineCOS7.METHODS:HumancblgenetaggedwithflagwasamplifiedfrompEFHAcblplasmidbyPCR.TheproductwasclonedintopGEMTeasy,seque

2、ncedandthensubclonedintoeukaryoticexpressingvectorpcDNA3.1(+).TherecombinedvectorwasthentransfectedintoCOS7cellswithlipofectinandtheexpressionofcblgenewasdetectedbyWesternblot.RESULTS:Theeukaryoticexpressingvectorencodinghumancblwassuccessfullyconstr

3、uctedanditsexpressioninCOS7cellscouldbedetected.CONCLUSION:TheeukaryoticexpressingvectorencodinghumancblisconstructedanditexpressesflagcblfusedproteincorrectlyinCOS-7cells.　　【Keywords】cbl;polymerasechainreaction;cloning,molecular;geneexpression　　【摘要】

4、目的：构建带有flag标签的人cbl基因真核表达载体，并检测其在真核细胞中的表达.方法：以含有人全长cblcDNA的质粒pEFHAcbl为模板，采用PCR方法扩增cbl基因，并在其N末端带上含24bp的flag标签，克隆到pGEMT10easy载体并测序，再亚克隆至真核表达载体pcDNA31(+)，酶切鉴定正确后采用脂质体法瞬时转染COS7细胞，Westernblot检测flagcbl在细胞中的表达.结果：测序证实以pEFHAcbl为模板获得的flagcbl融合基因的序列以及读框全部正确；重组质

5、粒pcDNA31(+)flagcbl经酶切后产生与理论预期长度相符的片段；脂质体法转染COS7后检测到预期目的蛋白的表达.结论：成功构建了N末端带flag标签的cbl真核表达载体，并使其在真核细胞COS7中表达.　　【关键词】cbl;聚合酶链反应;克隆，分子;基因表达　　0引言　　Cbl(casitasBlineagelymphoma,简称Cbl)是一类广泛分布的细胞内蛋白，在哺乳类中有Cbl、Cblb和Cbl33种.Cbl分子中含有多个不同的结构域，可以介导与不同的细胞内分子结合，在细胞活化过

6、程中可作为接头分子或支架分子参与信号转导；同时该分子中的RING结构域能够与泛素结合酶E2结合,作为泛素连接酶E3促进其结合的靶分子发生泛素化－蛋白酶体降解，因此参与细胞内信号转导的负调控机制［1］.近年来的研究表明，突变的Cbl可成为癌基因［2］；而许多肿瘤细胞内与增殖有关的分子（如受体型蛋白酪氨酸激酶，RTK）发生突变后则不再受Cbl的负调控［3］.我们成功构建了N－末端融合有flag标签的cbl10基因的真核表达载体，并采用脂质体法转染培养的COS7细胞，检测其是否正确表达，为进一步研究c

7、bl对肿瘤细胞生长的影响奠定基础.　　1材料和方法　　11材料　　大肠杆菌菌株DH5α、pcDNA31(+)真核表达载体、COS7细胞由本室保存；含人全长cblcDNA的质粒由美国LaJolla变态反应与免疫学研究所保存；pGEMTeasy购自Promega公司；dNTP、dATP、pyrobest高保真聚合酶、各种限制性内切酶、T4连接酶、DL2000DNAMarker购自Takara公司；1640培养基购自Gibico公司；LipofectamineTM2000购自invitrogen公司；

8、抗flagM2mAb和抗ACTIN抗体、HRP标记的羊抗鼠、兔第二抗体分别购自Sigma公司和博士德公司；Westernblot所用发光底物为pierce公司产品；用于PCR反应的引物由上海生物工程公司合成；质粒提取和DNA回收试剂盒由杭州维特洁公司提供.　　12方法　　121引物设计上游引物序列：5′GGTACCATGGACTACAAGGACGACGATGACAAGATGGCCGGCAACGTGAAGAAGAGC3′，其中GGT10ACC为KpnI酶切位点.下划线部分为编码flag标签的核苷酸