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1、利用FPLC系统结合自装层析柱纯化兔血清IgG1引言兔是最常用的动物模型之一，因此实验室经常需要分离兔血清IgG。所以建立简便、成本低、实用的分离兔血清IgG方法是非常重要的。在本实验中我们利用FPLC系统结合实验室常规手段填装的层析柱，摸索出一条实验结果稳定且成本大为降低的实验室分离兔血清IgG的方法。目前实验室纯化蛋白质主要有以下几种方法:（1）常压液相色谱（LC）,不借助其他任何大型仪器;这种方法虽然成本低,但是操作繁琐,实验结果检测需要很大的工作量；重复性不好；操作时间长，蛋白质易失活；（2）高
2、效液相色谱（highperformanceliquidchromatography，HPLC）法，快速、分辨率高，能够实时监测实验结果，但是易使生物大分子失活；（3）毛细管电泳（CE）：凝胶柱价格昂贵，寿命短，不适宜作为大规模分离蛋白质使用；（4）蛋白质快速液相层析（fastproteinliquidchromatograph，FPLC）：是专门用来分离蛋白质、多肽及多核苷酸的系统，是HPLC近年来的一项重要革新〔1〕,它不但保持了HPLC的快速、高分辨率等特性，而且还具有柱容量大、回收效率高及不易使生
3、物大分子失活等特性；因此在近年来在分离蛋白质〔2，3〕、多肽及寡核苷酸〔4,5,〕等方面得到了广泛应用。虽然FPLC具有以上的优点，但是购买商品化的预装柱和实验室常规手段填装的层析柱在价格上相比仍比较昂贵。为了进一步节省实验成本，在本实验中，我们利用实验室常规手段填装的凝胶柱Sephacryl-S200及离子交换柱DEAE-SephadexA-50进行分离纯化兔血清IgG的实验，结果证明本实验方法在大大降低实验成本的同时，可以得到纯度较高的兔IgG；并且还通过实验验证了本方法重复性及稳定性很好，与预装柱
4、的性能在这方面几乎没有差别。在实验中，我们选用了Sephacryl-S200，相比较于其它介质，其具有耐腐蚀、耐压、流速快等特点。尽管如此，实验中蛋白质的洗脱速度与预装柱相比仍较慢，大概为预装柱的1/2～1/4左右；可以在填充介质、装柱方法上加以改进，尽可能的提高流速，使本实验中的方法在其他生物大分子的纯化中得以推广和利用。2材料与方法2.1材料新西兰大白兔购自昆明医学院实验动物场，均为成年雄兔，体重2～3kg；Sephacryl-S200(Pharmacia)；DEAE-SephadexA-50(Ph
5、armacia)；SephadexG-25(Pharmacia)；碱性磷酸酯酶酶标羊抗兔IgG抗体（1：20000，SIGMA）；快速蛋白质液相层析系统（Fastproteinliquidchromatographysystem,FPLC系统，Parmacia公司产品）；蛋白质电泳器材（Eps600，Pharmacia）；酶标仪(PowerWavex，Bio-Tekinstruments)。2.2实验方法2.2.1硫酸铵分步沉淀法制备兔的血清免疫球蛋白〔6〕成年新西兰大白兔自颈动脉采血，在室温下静置1h
6、，4°C过夜；取上清，4°C，5000rap/min,离心25min；弃沉淀。重复一次。取xml兔血清，加入xml0.05mol/L,pH7.4的PBS,混匀；逐滴加入饱和硫酸铵溶液，至终浓度为50%，4°C过夜，充分沉淀蛋白；4°C，3500rap/min,离心25min，弃上清；加入xml0.05mol/L,pH7.4的PBS溶解沉淀，逐滴加入饱和硫酸铵溶液至终浓度33%，4°C放置2h；4°C，3500rap/min,离心25min，弃上清；重复33%饱和硫酸铵沉淀一次。2.2.2脱盐柱脱盐脱盐柱
7、的填充方法参照〔7〕，并稍作改进，在填装好的层析柱柱材料表面加一块直径为1.6cm的滤纸，并把缓冲液流进管延长至滤纸上方1～2cm处，以防缓冲液流速太快冲散层析柱表面。柱床体积为15×2.6cm。将1.2得到的粗提蛋白质用0.05mol/L,pH7.4的PBS溶解至合适的浓度，上脱盐柱SephadexG-25脱盐，上样量为3ml,以去离子水洗脱；重复上样9次。2.2.3凝胶柱纯化凝胶柱的填充方法同1.4，柱床体积为75×1.6cm。将盐析所得的蛋白质通过Sephacryl-S200柱层析进一步纯化。上样
8、量为2ml，洗脱液为0.05mol/L,pH8.0的Trsi-HCl。流速为0.5ml·min-1。记录蛋白质分离情况（图1）。得到两个峰，收集第二峰。2.2.4离子交换柱层析离子交换柱的填充方法同1.4。柱床体积为25×2.6cm。将上述通过Sephacryl-S200的第二峰蛋白质上离子交换柱DEAE-SephadexA-50进一步纯化。上样量为2ml。A本文由探生科技技术人员提供，如果您想了解更多关于生物仪器器械或抗体的信息，可以访问
