免疫组化相关问题-个人总结

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1、免疫组化步骤一般的sp法步骤啊，具体如下：1、烤片，68℃，20分钟，2.脱蜡：依次将载玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脱蜡作用的主要是二甲苯,依据的是相似相溶的原理.一般在每个试剂中放10min,天气热可以少放几分钟,相反,天气较冷的话,就要适当延长脱蜡时间,一般为12-15min.3.抗原修复：脱蜡后在清水中冲洗一段时间，加入3%H2O2-甲醇溶液浸泡10min，从而除去内源性的过氧化氢酶，然后倒掉H2O2，在清水中洗两次，再加入柠檬酸缓冲液，放入微波炉中蒸煮3min（中火），一般刚到沸腾即可，冷却至室温，然后再

2、蒸煮一次，冷却至室温，蒸煮的目的是为了使抗原的位点暴露出来。4.血清封闭：冷却至室温后，将柠檬酸缓冲液倒掉，水洗2次，并将载玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干组织周围的PBS液，马上加上血清，使一些非特异性的位点封闭起来，然后放入37°C温箱中半小时。血清稀释10倍（900µlPBS：100µl血清封闭液）。5.加一抗：将温箱中的载玻片取出，用吸水纸擦干载玻片反面和正面组织周围的血清，不洗，加一抗，如果做对照实验，就在对照的组织上加PBS。加完一抗后于4°C冰箱中保存过夜(≥18h)。6.加二抗：将载玻片从冰箱中取出，4℃过夜后在37℃复温45分钟，放入PBS中洗3次，每次5min

3、，擦干组织周围的PBS后加上二抗,然后置于37°C温箱中半小时。7.加SABC:将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上SABC,然后置于37°C温箱中半小时。SABC稀释100倍（990µlPBS：10µlSABC）。8.加显色剂：将片子从温箱中取出,放入PBS中洗3次，每次5min，擦干组织周围的PBS后加上显色剂。（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）A：DABB：H2O2C：磷酸缓冲液9.复染：将显色后的片子用清水冲洗一段时间后，浸泡于苏木精中染色，一般动物组织为半分钟，植物组

4、织3-5min。然后盐酸酒精分化。10.脱水：将复染后的片子置于水中冲洗后，依次将载玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每个试剂中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通风柜中。11.封片：用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上，要先放平一侧，然后轻轻放下另一侧，以免产生气泡，封好片子后置于通风柜中晾干。免疫组化技术要点1.固定最好用4%的多聚甲醛固定液。对于冰冻切片，甲醛固定有时比冰冻丙酮好；但对于不同的组织和抗原，可选用不同的固定液。有时候商品化的抗体会有比较适合而推荐的固定液，请于购置前注意说明书。（1）BouinS

5、固定液：饱和苦味酸750ml，甲醛250ml，冰醋酸50ml，其对组织的穿透力较强，固定较好，结构完整，但因偏酸，对抗原有一定损害，且组织收缩明显，不适于组织标本的长期保存。（2）PLP液：即高碘酸钠-赖氨酸-多聚甲醛，适于固定石蜡切片。适于富含糖类组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。2.组织脱水、透明时间不能太长，否则在切片时容易碎片，切不完整。3.切片时展片有些组织在切片后难以在水中展开，这时可适当地在水中加入几滴乙醇。4.烤片60℃30分钟或37℃过夜，温度太高或时间太长，抗原容易丢失。5.蜡块及切片的保存最好在4℃保存.6.脱片问题Poly-L-Lysine(多聚赖氨酸

6、)为目前免疫组化染色工作中最常用的一种防脱片剂，6ml的多聚赖氨酸溶液可按1:10稀释成60ml的工作液，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。如不行，可用双重处理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上两种条件都行不通的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前，放在APES1:50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干，即可进行下一步。7.灭活内源性酶（1）HRP系统：3%双氧水灭活（2）AP系统：3%HAc灭活。8.暴露抗原对于石蜡切片的免疫组化实验时，必须采用高温加热抗原修复，这将有助于暴露抗原决定簇，从而增加免疫组化染色的强度(不同抗体的最佳修复液请参阅抗体说明书)。对于不

7、同的组织，不同的抗原，不同的抗体，所采用的方法应不一样，可进行热修复、胰酶消化、既不修复也不消化。胶原还可以用胃蛋白酶消化等。9.封闭在山羊血清封闭，非特异性染色仍然较强时，可延长封闭时间或用浓缩血清封闭10.抗体稀释应遵循“现用现配”的原则，对于PBS稀释的抗体一定要当天使用。11.背景高在抗体浓度、反应时间、反应温度等合适的条件下，如果背景依旧高，可采用含1‰Tween20的PBS洗，特别是在显色之前要多洗。12.返蓝在苏木素复染后，可用碱