实验三 酵母rna的提取及含量测定

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1、华南师范大学实验报告学生姓名吴志军学号20082502046专业生物工程年级、班级08工程1班课程名称下游技术实验项目酵母RNA提取实验类型验证设计综合实验时间2011年10月17日实验指导老师江学文实验评分实验三酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。其中苯酚法又是

2、实验是最常用的。组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。上述方法提取的RNA具有生物活性。工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后,上清液用乙醇沉淀RNA。稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用

3、乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm波长的紫外光。核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩

4、尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。核酸的摩尔消光系数不是一个常数，而是依赖于材料的前处理、溶液的pH和离子强度发生变化。RNA溶液（pH=7.0）的ε（ρ）=7700-7800，RNA的含磷量为9.5%，含1μg/mLRNA溶液的光密度为0.022-0.024。因此，测定未知浓度的DNA（RNA）溶液的光密度OD260nm，即可计算测

5、出其中核酸的含量。该法简单、快速、灵敏度高，如核酸3μg/mL的含量即可测出。对于含有微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质的核酸样品，测定误差较小。蛋白质由于含有芳香族氨基酸，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm波长处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中的蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。三、主要仪器和试剂啤酒酵母粉0.04MNaOH溶液95%乙醇、乙醚、酸性乙醇溶液：30mL乙醇加0.3mLHCl。紫外分光光度计离心机真空干燥箱三角瓶、烧杯水浴锅四、实验

6、步骤1、称5g干酵母粉悬浮于30mL0.04MNaOH溶液中，并在研钵中研磨均匀。2、悬浮液转入三角烧瓶，沸水浴加热30min，冷却，转入离心管，3000转/分，离心15分钟后，将上清慢慢倾入10mL酸性乙醇，边加边搅动。3、加毕，静置，待RNA沉淀完全后，3000r/min离心3min。弃去上清液。用95％乙醇洗涤沉淀两次。4、再用乙醚洗涤沉淀一次后，用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗抽滤，沉淀在空气中干燥。称量所得RNA粗品的重量，5、纯度测定：将样品配制成含5～50μg核酸/mL的溶液，于紫外分光光度计上测定

7、260nm和280nm吸收值，计算核酸浓度和两者吸收比值。五、计算：O.D260为260nm波长处的光密度读数；L为比色杯的厚度，一般为1或0.5；0.024为1μgRNA/mL的光密度；0.020为1μgDNA/mL的光密度。六、实验结果与分析各小组测得的实验数据如下表：组别稀释倍数吸光值（OD260）116667倍0.523212500倍0.593314000倍0.474412500倍0.574512500倍0.605其中本小组为第5小组，稀释倍数为12500倍，测得的吸光值（OD260）为0.605。

8、将酵母粉处理后得到的沉淀的重量为：0.46g。滤纸滤纸+沉淀沉淀重量（g）0.30400.76040.4564其中RNA粗品占沉淀的70%，杂质占沉淀的30%，故RNA粗品的重量为：0.46×0.7=0.322g。纯度测定结果为：RNA浓度（ug/g）==RNA纯品的质量（ug）=RNA浓度×RNA粗品的重量=故甘酵母粉中RNA含量（%）===2.02%分析：实验的结果测出RNA的含量为2.02%，其RNA的含量