abo血型全自动微板检测法

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1、本站最近研究开发了ABO血型全自动微板检测法，并对2857名献血者进行ABO血型鉴定，一次判读准确率达到99.83%。该法的应用大大地降低了实验者的工作强度，避免了人为因素导致的错判血型，确保了临床输血的安全。笔者着重对该方法的可靠性和干扰因素进行研究，结果报告如下。　　1　材料和方法　　1.1　材料　2857份献血者血液标本（2.5mgEDTANa2/ml抗凝全血）；GenesisRSP-100型全自动样本处理系统，SLT自动扫描酶标仪及随机购置的支持软件Soft2000(瑞士TECAN公司产品)；T.S温控孵育振荡仪（奥地利Anthos公司）；KUBOTAKs-5000平板

2、式离心机（日本久保田公司）；96孔硬质U型板（丹麦）；单克隆抗-A、抗-B血清（长春生物制品研究所）；5%3人份以上混合试剂红细胞（自制）；A2亚型红细胞（Ortho公司产品），经盐水洗涤2次配成5%的盐水悬液。　　1.2　全自动微板检测法（简称微板法）　用96孔U型微量反应板，通过全自动加样器处理样本和试剂。正定型中，分别加入标准抗血清30μl和5%样本红细胞30μl，反定型中，分别加入样本血浆50μl和5%标准红细胞30μl。经孵育、离心、悬浮和静止，再用自动酶标仪取620nm波长对反应板进行扫描、判读，随后在电脑中进行正反定型结果配对比较，确认无误后，将最终正确结果经站电

3、脑网络与相应献血者资料存放在一起。经多次正交试验检测和各参数指标间的对比试验，优化得出ABO正反定型检测最终试验条件为，孵育：3min，500r/min，2level；离心：400g，90s；悬浮：3min，900r/min，3level；静止：正定型1～2min，反定型5～6min；判读：620nm波长，40点扫描，Tc＞15%为凝集反应，Tc＜10为非凝集反应，10≤Tc≤15为可疑，需手工法重新鉴定。依据Soft2000支持软件结构，微凝板经扫描后每孔都可获得一最小透光率（minimumtransmission,Tn）和最大透光率(maximumtransmission,

4、Tm)，非凝集孔Tm与Tn的差值（contrasttransmission,Tc）较小，凝集孔Tc值较大；当Tc值超过一特定值时，提示细胞凝集，结果判为阳性；反之，Tc值较小时表明细胞不凝集，结果判为阴性。根据ABO正反定型原则［3］，确定其血型。　　1.3　试管法，平板法　见文献［3］方法。　　2　结果　　2.1　方法的可靠性　　2.1.1　可重复性　取8份样本，连续进行20次反定型，每次得阳性Tc值9个，阴性Tc值7个，分别算出它们的平均Tc值，然后对20份阳性和阴性的平均Tc值分别进行数理统计，依次得标准差(s)为2.091、0.295和变异系数(cv)为2.91%、8.

5、03%，均＜10%，说明该试验具有良好的可重复性。　　2.1.2　稳定性　取48份标本，连续进行3次正反定型，每次间隔11d,显示：正定型凝集试验中均为4+，无任何变化;而对反定型凝集试验中的Tc值按配对资料的两两比较进行数理统计，无显著性差别、(t＝0.387，n=62，经查表，t0.05=2.000,故P＞0.05)。　　2.1.3　准确率　通过2857份献血者样品的正反定型，得出正反定型试验1次判读准确率为99.83%，证明该试验方法完全可靠。异常结果主要出现在反定型中，其中3份样本为严重脂血，2份为血型抗体极弱。　　2.1.4　敏感性　将单克隆-抗A血型试剂倍比稀释，每

6、种稀释度加样30μl，再分别加入5%A型和A2亚型红细胞悬液30μl，按上述3种方法进行操作，分别测得其结果（表1）。用B型血浆代替上述单克隆抗-A，加样量改为50μl，其余不变，分别测得其结果（表2）。表1　A和A2亚型红细胞在3种方法中测得单克隆抗-A效价　单抗A血型试剂倍比稀释效价原液1／21／41／81／161／321／641／1281／2561／512微板法A58.567.677.280.582.676.760.226.717.65.8256A258.772.478.979.874.260.151.418.06.73.1128试管法A4＋4＋4＋4＋4＋3＋2＋±－－

7、128A24＋4＋4＋3＋3＋1＋±－－－64平板法A4＋4＋4＋4＋3＋2＋1＋±－－128A24＋4＋3＋3＋3＋1＋±－－－64表2　分别用A和A2亚型红细胞在3种方法中测B型血浆中抗-A效价　B型血浆倍比稀释效价原液1／21／41／81／161／321／641／128微板法A75.771.461.537.517.515.47.35.532A271.943.419.715.98.86.14.64.48试管法A4＋4＋3＋2＋±－－－16A24＋2＋1＋±－－－－8平板法A3＋3＋2＋1